Search for genetic determinants of resistance to auxin herbicides in poppies (Papaver rhoeas L.) for diagnostic purposes
Recherche de déterminants génétiques de la résistance aux herbicides auxiniques chez le Coquelicot (Papaver rhoeas L.) dans un but de diagnostic
Résumé
Corn poppy (Papaver rhoeas) is a very widespread cosmopolitan weed in winter crops cereal in Europe which has a high potential for invasion and spread in crops. It is mainly controlled by ALS inhibitor herbicides and auxin herbicides. The intensive use of these two modes of action has led to the evolution of resistance in many poppy populations across Europe. Herbicide resistance involves two categories of mechanisms: target-site-based resistance (TSR) and non-target-site-based resistance (NTSR). In poppy, only NTSR mechanisms have been identified, but the specific genes remain unknown. This work therefore has several goals: (i) identify and potentially validate the genetic determinants of resistance to auxin herbicides in corn poppy and (ii) evaluate resistance status to auxin herbicides in French poppy populations.In a first part, we phenotypically characterized the plant material available using herbicides sensitivity bioassays (Chapter 1) to assess the resistance status of poppies to auxin herbicides in France. We have shown that resistance to 2,4-D in France was widespread, even very well established in certain areas. We also identified two areas in Italy and Greece where resistant plants to halauxifen-methyl were detected, suggesting the beginning of the evolution of resistance to this new synthetic herbicide. Populations with a balanced ratio of resistant and sensitive individuals were used for plant material production for the molecular biology approaches of the second part.In a second part, we studied constitutive resistance to 2,4-D and halauxifen-methyl among 14 populations via RNA sequencing (RNAseq) (Chapter 2). We showed that the expression profiles of sensitive and resistant plants were specific to each population. Among the genes differentially expressed in resistant plants, some gene families potentially involved in the metabolism of herbicides (CYP450, GST, ABC transporters, etc.) or regulatory cascades (transcription factors, protein kinases) have been identified. Based on these results, the expression level of these genes was validated via an RT-qPCR approach using a larger sample of plants. All the results indicate that there is potentially a wide variety of inter- and intra-population resistance mechanisms.The second RNAseq (Chapter 3) aimed to study the transcriptomic response of resistant and sensitive plants between 4h and 48h after the application of 2,4-D in two populations. We identified a large diversity of genes and gene families specifically induced in resistant plants from both populations, but their role in resistance could not be verified. As in constitutive resistance, these can potentially be detoxification enzymes, transporters, or even potential auxin target genes or genes associated with the general stress response. In addition, 2,4-D induces a rapid response which is detectable within 4 hours following treatment regardless of the phenotype and population.Finally, the comparison of constitutively differentially expressed genes between the two RNAseq approaches demonstrates that the absence of common genes is potentially due to a high diversity of intra- and -inter population resistance mechanisms, or to the fact that the mechanisms that contribute the most to resistance are due to structural mutations.
Le coquelicot (Papaver rhoeas) est une adventice cosmopolite très répandue dans les cultures de céréales d’hiver en Europe qui présente un haut potentiel d’invasion et de propagation dans les cultures. Il est principalement contrôlé par les herbicides inhibiteurs de l’ALS et les herbicides auxiniques. L’utilisation intensive de ces deux modes d’action à conduit à l’évolution de la résistance dans de nombreuses populations de coquelicot à travers l’Europe. La résistance aux herbicides implique deux catégories de mécanismes : la résistance liée à la cible (RLC) et la résistance non liée à la cible (RNLC). Chez le coquelicot, seuls des mécanismes de RNLC ont été identifiés, mais les gènes spécifiques restent inconnus. Ce travail de thèse a donc plusieurs objectifs : (i) identifier et potentiellement valider les déterminants génétiques de la résistance aux herbicides auxiniques chez le coquelicot et (ii) évaluer la présence de résistance aux herbicides auxiniques dans des populations françaises de Coquelicot. Dans une première partie, nous avons caractérisé phénotypiquement le matériel végétal disponible via des tests biologiques de sensibilités aux herbicides (Chapitre 1) pour évaluer la situation de la résistance des coquelicots aux herbicides auxiniques en France. Nous avons montré que la résistance au 2,4-D en France était répandue, voire très bien installée dans certaines zones. Nous avons également identifié deux parcelles en Italie et en Grèce où des plantes résistantes à l’halauxifène-méthyl ont été détecté, suggérant un début d’évolution de la résistance à ce nouvel herbicide de synthèse. Les populations avec un ratio équilibré d’individus résistants et sensibles ont été utilisées pour la production de matériel végétal pour les approches de biologie moléculaire de la deuxième partie.Dans une deuxième partie, nous avons étudié la résistance constitutive au 2,4-D et à l’halauxifène-méthyl parmi 14 populations via le séquençage de l’ARN (RNAseq) (Chapitre 2). Nous avons montré que les profils d’expression des plantes sensibles et résistantes étaient propres à chaque population. Parmi les gènes différentiellement exprimés chez les plantes résistantes, certaines familles de gènes potentiellement impliqués dans la métabolisation des herbicides (CYP450, GST, transporteurs ABCs etc.) ou des cascades de régulation (facteurs de transcription, protéines kinases) ont été identifiées. Sur la base de ces résultats, le niveau d’expression de ces gènes à été validé via une approche de RT-qPCR à partir d’un échantillon plus large de plantes. L’ensemble des résultats indiquent qu’il existe potentiellement une grande variété de mécanismes de résistance inter- et intra-population. Le deuxième RNAseq (Chapitre 3) visait à étudier la réponse transcriptomique des plantes résistantes et sensibles entre 4h et 48h après l’application du 2,4-D dans deux populations. Nous avons identifié une grande diversité de gènes et de familles de gènes spécifiquement induits chez les plantes résistantes des deux populations, mais leur rôle dans la résistance n’a pas pu être vérifié. Comme dans la résistance constitutive, il peut potentiellement s’agir d’enzymes de détoxication, de transporteurs, voire de potentiels gènes cibles de l’auxine ou de gènes associés à la réponse générale au stress. De plus, le 2,4-D induit une réponse rapide qui est détectable dans les 4h suivant le traitement quels que soient le phénotype et la population. Enfin, la comparaison des gènes différentiellement exprimés de façon constitutive entre les deux approches de RNAseq démontre que l’absence de gènes communs est potentiellement due à une diversité élevée de mécanismes de résistance intra- et -inter populations, ou au fait que les mécanismes qui contribuent le plus à la résistance sont dû à des mutations de structure.
Origine : Version validée par le jury (STAR)