Cell-free protein expression : from in vitro control to proteoliposomes

Expression de protéines par voie " cell-free " : de la régulation in vitro aux protéoliposomes

Grégory Hansen (1)

1 PASTEUR - Processus d'Activation Sélective par Transfert d'Energie Uni-électronique ou Radiatif (UMR 8640)

Throughout Transcription and Translation, every single living organism converts the genetic information it carries into functional proteins. These fundamental mechanisms are nowadays mastered up to their biochemical level, enabling us to produce in vitro proteins from synthetic DNA fragments, by the use of so called Cell-free systems. This minimalistic approach of gene expression represents both a tool to unravel biological mechanisms and a platform to develop new biotechnology applications. In spite of these credits, controlling these systems (triggering, regulation) is still scarcely achieved. The aim of the thesis is first of all to explore new means of metabolic regulation for gene expression in cell-free systems, by studying the influence on expression levels of biochemical and energetic factors. I then focus the research to establish a reversible control comprising the coupling of an enzyme and an antibiotic. Moreover, I demonstrate that the inhibition caused by this antibiotic can be used to study the maturation kinetics of fluorescent proteins. Finally, I describe an innovative, one-pot, protocol to prepare functional giant proteoliposomes, enabling simultaneously in situ expression of the eukaryotic membrane proteins and their post-translational modifications. This approach is then applied to reconstitute membranous pores triggered by thermal changes or specific enzymatic activity.

Tous les organismes vivants convertissent leurs informations génétiques en protéines fonctionnelles par des mécanismes de transcription/traduction. Ces phénomènes fondamentaux de la biologie sont maintenant maitrisés au niveau biochimique, et il est possible par le biais de systèmes dits " cell free " de produire des protéines in vitro à partir de fragments d'ADN synthétiques. Ces systèmes minimaux d'expression génique représentent autant un outil fondamental pour la compréhension des mécanismes du vivant qu'une plateforme pour de nombreuses applications biotechnologiques. Néanmoins, le contrôle (déclenchement, régulation) de ces systèmes reste limité en comparaison de leurs analogues naturels. Dans cette thèse, j'explore tout d'abord des moyens de régulation de l'expression en système cell-free par voie métabolique, en étudiant l'influence de différents facteurs biochimiques ou énergétiques. Je m'intéresse ensuite à la mise en place d'un contrôle réversible en exploitant un couplage antibiotique/enzyme. Je montre également que l'inhibition produite par cet antibiotique peut être exploitée pour étudier les cinétiques de maturation des protéines fluorescentes. Enfin, je décris un protocole innovant de préparation de protéoliposomes géants fonctionnels permettant à la fois l'expression in situ de protéines membranaires eucaryotes et leur modification post-traductionnelle. Cette approche est appliquée en particulier pour la reconstitution de pores membranaires déclenchables par voie thermique ou enzymatique.

Mots clés: Cell free expression; Reconstituted systems; Fluorescent proteins

Mots clés: Expression cell-free; Systèmes reconstitués; Protéines; Auto-assemblage; Membranes artificielles; Liposomes

Domaines: Chimie organique

Grégory Hansen. Expression de protéines par voie " cell-free " : de la régulation in vitro aux protéoliposomes. Chimie organique. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2015. Français. ⟨NNT : 2015PA066543⟩. ⟨tel-01322409⟩