Research of determinants controlling cadmium accumulation in lettuce "Lactuca sativa".
Recherche et caractérisation de déterminants contrôlant l'accumulation de cadmium chez la laitue "Lactuca sativa".
Résumé
Cadmium is an extremely toxic pollutant causing a great number of diseases. It is a widespread metal which concentration rises in cultivated soils, thus exposing food or feed crops to it and ultimately causing potential major sanitary problems as a consequence of its entry in the food chain. Among the vegetable species used for food, lettuce shows a higher capacity of accumulating cadmium.
Our objective was to identify molecular determinants controlling cadmium accumulation in lettuce.
We aim at characterizing mechanisms controlling cadmium accumulation in lettuce, which is a food crop showing one of the highest capacities to accumulate this toxic compound.
Starting from a phenotypic and transcriptomic analysis of 18 lettuce genotypes representing the genetic diversity of the species, we identified trends linking cadmium and zinc accumulation in roots an shoots, cadmium translocation from roots to shoot, cadmium tolerance, and expression of a dozen of candidate genes proposed to be involved in cadmium transport. A positive correlation linked cadmium accumulation and the mRNA accumulation of an heavy metal efflux transporter. Interestingly, measurements of 109Cd influx in roots and 109Cd efflux from roots revealed that the genotype displaying the least cadmium accumulation could be discriminated from the genotype displaying the highest one by its markedly increased ability to efflux cadmium from the roots to the culture medium. Progeny analysis from crosses between the genotypes displaying extreme performances for cadmium accumulation or cadmium translocation from roots to shoots revealed that these traits could be supported by single genetic determinism.
In conclusion, starting from the analysis of cadmium accumulation in a large set of lettuce genotypes, a major determinant limiting cadmium accumulation in this species was revealed, that is the ability to efflux cadmium from the root to the culture medium. A candidate gene has been identified for this function, which paves the way towards the breeding for lettuce with reduced cadmium accumulation in leaves.
As a non-essential element for plants, cadmium has been assumed to be taken up by making use of non-specificity of essential elements transporters. Numerous physiological studies have described that cadmium uptake is negatively associated with iron pathway, by competing for absorption sites in roots. The principal candidate for this transport in lettuce is a possible “orthologue” of Arabidopsis thaliana IRT1. In fact, AtIRT1 is a major transporter responsible for iron uptake from the soil, and is known to have a broad substrate range, including cadmium. IRT1-overexpressing A. thaliana plants were then shown to accumulate more cadmium in root tissue.
In this work, NCBI sequence libraries were analysed and two lettuce “orthologues” of AtIRT1 were found (LsIRTa and LsIRTb). Cloning “orthologues” of AtIRT1 was carried out for five lettuce varieties. Moreover, LsIRTs expression in plants from 14 lettuce accessions were analysed by PCRQ and were compared to cadmium accumulation in plants. Interestingly, our results revealed that expression of LsIRTa is significantly correlated with root cadmium content. LsIRTa seems to be involved in the control of cadmium accumulation in roots.
This result has been supported by tow physiological experiments. The first experiment showed that increasing iron in the growth medium resulted in a strong decrease in root cadmium content. And conversely, the second experiment revealed that root iron content decrease in response to increasing concentrations of cadmium in the medium. These results suggest that cadmium competes with iron for uptake through ion transporters in lettuce root cells. As mentioned above, a candidate gene for this transport has been identified (LsIRTa), which paves the way towards the breeding for lettuce with reduced cadmium accumulation.
Les activités humaines agricoles, urbaines et industrielles, sans cesse croissantes, sont à l'origine d'une contamination de notre environnement par les métaux lourds. Alors que de nombreuses molécules organiques peuvent être dégradées, les métaux lourds ne le peuvent pas et leur concentration augmente régulièrement dans les sols et les eaux. Ceci expose les plantes à des concentrations croissantes de métaux lourds. L’accumulation de métaux lourds dans les plantes présente un risque toxique pour l’Homme, car les plantes cultivées sont le point d’entrée dans la chaîne alimentaire. Par comparaison aux autres espèces, la laitue « Lactuca sativa » a tendance à présenter des teneurs élevées en cadmium, un métal lourd très toxique dont la concentration croît régulièrement dans les sols cultivés pour des raisons environnementales. En termes de sécurité alimentaire, il est donc important de produire des variétés accumulant des teneurs en cadmium réduites, et la laitue est un bon modèle pour débuter ce type d’approche.
L’objectif de notre thèse était de caractériser aux niveaux physiologique, génétique, et moléculaire, les déterminants majeurs contrôlant l’accumulation du cadmium chez la laitue. Notre objectif a été décliné en différentes opérations. Tout d’abord une analyse de diversité nous a permis de décrire la capacité d’accumulation de cadmium de 18 génotypes de laitue et de sélectionner des génotypes présentant des performances extrêmes vis-à-vis du cadmium. Ainsi, des génotypes présentant des performances extrêmes du point de vue de la tolérance au cadmium, de l’accumulation de cadmium et de la capacité de translocation du cadmium des racines vers les parties aériennes ont été sélectionnés.
Dans une deuxième étape, nos variétés extrêmes pour les caractères d’accumulation de cadmium et de translocation de cadmium des racines vers la partie aérienne ont été utilisées pour développer une approche physiologique. L’objectif de cette approche était de montrer l’origine de leur variabilité afin de comprendre les déterminants physiologiques contrôlant l’accumulation du cadmium chez la laitue.
Dans le cadre de cette approche, des expériences d’efflux faites en utilisant du cadmium radioactif (109Cd) ont montré que la variété la moins accumulatrice de cadmium se caractérise par un efflux de cadmium marqué plus important par comparaison aux autres variétés. Cette variété possède vraisemblablement un mécanisme d’efflux plus efficace par comparaison aux autres variétés qui pourraient être le déterminant majeur permettant d’obtenir une plus faible accumulation de cadmium chez cette variété.
Notre étude a permis de montrer une forte corrélation positive entre teneur en cadmium et teneur en zinc. Ce qui a permis d’émettre l’hypothèse d’un transport très associé entre le cadmium et le zinc. De même, une corrélation positive entre le niveau de translocation de cadmium des racines vers la partie aérienne et le niveau relatif du citrate entre les racines et les feuilles a été montrée. Cette corrélation suggère que le citrate pourrait être impliqué dans le transport du cadmium.
Enfin, notre étude physiologique a permis de mettre en évidence un effet dépressif de l’augmentation des concentrations de fer et de calcium dans le milieu de culture sur l’accumulation du cadmium chez nos plantes de laitue.
Ceci permet de penser que l'absorption de cadmium peut se faire d’une manière non spécifique via des transporteurs de fer et/ou de calcium.
Dans le but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’accumulation du cadmium chez la laitue nous avons élaboré une approche génétique. Cette approchea visé à préciser le déterminisme, simple ou complexe, des caractères d’accumulation de cadmium et de translocation du cadmium des racines vers les parties aériennes. Pour cela des croisements ont été réalisés entre les génotypes les plus extrêmes pour ces caractères. À la suite de ces croisements, les populations F1 et F2 ont été analysées.
Les résultats de l’analyse des plantes F1 ont montré qu’on est en présence d’une dominance forte, voire absolue, des caractères qui assurent la sensibilité au cadmium, la forte accumulation du cadmium et la forte translocation du cadmium des racines vers les parties aériennes. De même, pour ces trois caractères étudiés, les plantes F1 issues des deux sens de croisement ont montré un comportement identique vis-à-vis du cadmium ce qui prouve que nos caractères ne sont pas des liés au sexe.
Les analyses des plantes F2 pour les deux caractères accumulation de cadmium et translocation de cadmium des racines vers les parties aériennes ont permis de montrer que la distribution phénotypique n’est pas bimodale pour les deux caractères étudiés, indiquant que ces caractères ne présentent pas des cas typiques de monohybridisme. Ces deux caractères sont donc contrôlés par plus qu’un seul gène pour chacun d’entre eux.
Dans le but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’accumulation du cadmium chez la laitue, nous avons complété les approches d’analyse de la diversité, de physiologie et de génétique par une approche moléculaire. Cette approche avait comme objectif l'identification de corrélations, si elles existent, entre l'accumulation de cadmium dans les racines et/ou les feuilles et le niveau d’expression de gènes candidats décrits chez les espèces modèles comme impliqués dans le contrôle de l’accumulation de cadmium. Cette approche a permis de cloner et de séquencer des fragments d’ADN correspondant à 9 gènes candidats de laitue et d’évaluer le niveau de leurs expressions par PCR quantitative. Ensuite, l’expression de ces gènes a été comparée aux teneurs en cadmium et en zinc mesurées dans les racines et/ou les feuilles.
À la suite ce cette étude nous avons pu mettre en évidence une éventuelle implication d’un gène de laitue (que nous avons nommé LsIRTa) dans l’accumulation du cadmium. Ce gène est très probablement un orthologue fonctionnel du gène AtIRT1 qui code un transporteur représentant la principale voie d'absorption du fer par les cellules racinaires d’Arabidopsis thaliana. D’autre part, nos résultats ont montré une corrélation positive entre l’expression d’un autre gène (que nous avons nommé LsPDRa) et l’accumulation du zinc et du cadmium au niveau foliaire, ce gène est donc très probablement impliqué dans l’accumulation de ces deux métaux à ce niveau, ce qui confirme davantage notre hypothèse de transport associé entre le cadmium et le zinc.
Fichier principal
Thèse de Doctorat - Walid ZORRIG - SupAgroMontpellier - FST.pdf (5.2 Mo)
Télécharger le fichier