Structural insight into photobleaching mechanisms of reversible photoswitchable fluorescent proteins

C. Duan
Résumé : La découverte des Protéines Fluorescentes Phototransformables (PTFPs) issues d’espèces anthozoaires a ouvert, grâce à leurs propriétés photophysiques particulières, un vaste champ d’investigation pour l'imagerie biologique de fluorescence. L'un des sousgroupes des PTFPs est formé des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables (RSFPs), qui peuvent être commutées réversiblement entre des états non-fluorescent et fluorescent. Le photoblanchiment est la perte définitive d’émission de fluorescence sous excitation et est un phénomène commun à toutes les molécules fluorescentes. Le photoblanchiment a un impact important sur la qualité des images de microscopie, notamment en imagerie de super-résolution. Les RSFPs ont tendance à perdre de leur performance à chaque cycle de commutation, un processus dénommé “photofatigue”. Notre intérêt est centré sur l'étude des mécanismes de photofatigue des RSFPs. Nous avons rapporté les structures cristallographiques d’IrisFP photoblanchie par une forte et une basse intensité d’illumination à température ambiante ainsi que les modifications spectroscopiques associées. Nos résultats démontrent que différentes intensités d'excitation peuvent donner lieu à différentes voies de photoblanchiment. Sous faible intensité d'excitation, une voie de photoblanchiment dépendante de l'oxygène a été mise en évidence. Les modifications structurales induites par la production d'oxygène singulet à l'intérieur de la poche du chromophore ont révélé l'oxydation de deux résidus soufrés, Met159 et Cys171, piégeant le chromophore dans un état protoné non-fluorescent. Sous haute intensité d'excitation, une voie de photoblanchiment oxygène-indépendante totalement différente a été trouvée. Le Glu212, strictement conservé, subit une décarboxylation associée à un important réarrangement du réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore, et un changement d’hybridation sp2 vers sp3 du carbone reliant les cycles du chromophore est observé. En tant que résidu clé impliqué dans le photoblanchiment induit par faible intensité d'excitation, nous avons muté Met159 en alanine afin d'éviter une sulfoxydation. Nous avons trouvé que le mutant IrisFP-M159A démontre une photostabilité améliorée en solution, en gel PVA et dans des cellules E. coli.
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Contributeur : Chenxi Duan <>
Soumis le : vendredi 19 décembre 2014 - 11:56:56
Dernière modification le : jeudi 12 mai 2016 - 17:49:08
Document(s) archivé(s) le : samedi 15 avril 2017 - 11:31:52

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  • HAL Id : tel-01097264, version 1

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C. Duan. Structural insight into photobleaching mechanisms of reversible photoswitchable fluorescent proteins. Biophysics. IBS, 2014. English. 〈tel-01097264v1〉

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