Biochemical characterization of YphC, a protein from Bacillus subtilis with two GTPases domains.

CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DE YPHC, UNE PROTEINE DE BACILLUS SUBTILIS A DEUX DOMAINES GTPASE IMPLIQUEE DANS LA BIOGENESE DU RIBOSOME

Anne-Emmanuelle Foucher (1)

1 IBS - UMR 5075 - Institut de biologie structurale

Genome sequencing programs have revealed many genes of unknown function. The systematic disruption of these genes revealed the essentiality for some of them. Studying orphan proteins became of first importance as they are ideal targets for new antibacterial compounds. YphC is a GTPase from Bacillus subtilis that meets these criteria. It is well conserved throughout bacterial kingdom but is not found in eukaryota or archeas, strengthening the choice of this protein as a future target for antibacterial drugs. YphC has the particularity to possess two GTPase domains in tandem. As a unique protein, we decided to study YphC from a biochemical point of view to better understand its catalytic mechanism. We overexpressed and purified the protein, either wild type or mutants. We measured its enzymatic constants and characterize potassium activation effect on its hydrolytic activity. We showed that YphC displays a high GTPase activity and that GD1 bears the majority of this activity .GD2 would thus have a regulatory role in the protein. We also studied the role of YphC in vitro. We showed that the protein was able to interact with ribosome from Bacillus subtilis in a nucleotide dependant manner, suggesting that YphC plays a role in ribosome biogenesis.

Les grands programmes de séquençage des génomes ont révélé l'existence de nombreux gènes de fonction inconnue. L'invalidation systématique de ces gènes chez les bactéries a permis de révéler le caractère essentiel de certains d'entre eux. L'étude des protéines issues de ces gènes s'est amplifiée ces dernières années car elles sont des cibles potentiellement intéressantes pour le développement de nouvelles molécules antibactériennes. YphC est une GTPase de Bacillus subtilis qui répond à ces critères. Elle est très conservée au sein des bactéries mais n'est pas retrouvée chez les organismes eucaryotes ou les archaebactéries, ce qui fait d'elle une cible de choix pour le développement de nouvelles molécules antibactériennes. YphC a la particularité de posséder deux domaines GTPases en tandem. Unique en son genre, nous avons voulu étudier cette protéine sous son aspect biochimique afin de mieux comprendre son mécanisme de fonctionnement. Nous avons donc mis au point la production et la purification de YphC et généré des mutations ponctuelles ou des délétions. Nous avons ainsi pu mesurer les constantes enzymatiques de cette protéine et caractériser l'effet d'activation du potassium sur son activité d'hydrolyse du GTP. Nous avons ainsi montré la forte activité GTPase de la protéine portée par le premier domaine GTPase et le rôle régulateur du deuxième domaine GTPase. Nous avons également étudié le rôle de YphC par une approche in vitro. Nous avons pu ainsi montrer que YphC est capable d'interagir avec les ribosomes de façon nucléotide dépendante suggérant un rôle de la protéine dans les processus de biogenèse du ribosome.

Mots clés: GTPase; EngA; Ribosome; Bacillus subtilis

Domaines: Biochimie [q-bio.BM]

Anne-Emmanuelle Foucher. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DE YPHC, UNE PROTEINE DE BACILLUS SUBTILIS A DEUX DOMAINES GTPASE IMPLIQUEE DANS LA BIOGENESE DU RIBOSOME. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00539850v2⟩