Functional and structural studies of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit muscle or after its heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae

Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae

C. Montigny (1)

1 SMPSD - Système membranaires, photobiologie, stress et détoxication

Sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase isoform 1a (SERCA1a), prepared from rabbit fast-twitch muscle, is a membrane protein which catalyses active transport of two calcium ions from the cytosol into the reticulum lumen. Since 2000, several high resolution structures for this protein have been obtained, and these structures have contributed a lot to the current understanding of the catalytic and transport cycle (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). However, until 2007, all crystallized forms of the Ca2+-deprived ATPase had been obtained in the presence of inhibitors, bound to the protein transmembrane domain. First, we used fluorescence spectroscopy and proteolytic cleavage to demonstrate that inhibitors bound to membrane domain, which prevent the ATPase from exploring some of the « normal » conformations of its catalytic cycle, had probably induced biases in some of the structures published before 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Crystallization of new forms by our colleagues abroad, in the absence or presence of inhibitors, confirmed our findings. These inhibitors had up to now been used to stabilize the protein during the crystallization process and prevent it from detergent-induced irreversible denaturation (Lund, Orlowski et al. 1989). By using glycerol alone, instead, to stabilize the detergent-solubilized protein, we were able to pinpoint specific and unexpected effects, on the protein, of some of the detergents commonly used in this field (Montigny, Arnou et al. 2008). Again using glycerol, we were able to characterize various features of three particular mutants of the ATPase, previously expressed heterologously in the yeast S. cerevisiae and purified in detergent, one of these mutants being able to bind only one Ca2+ (Montigny, Arnou et al. 2008), and the two other mutants being blocked at particular steps in the ATPase catalytic cycle (Marchand, Winther et al. 2008). Independently, we elucidated the reason for the previously-described extremely low fluorescence of FITC-labelled Ca2+-ATPase under certain conditions: we found that the tethered fluorescein, unexpectedly, had become phosphorylated during catalysis. The experimental conditions required for such phosphorylation imply that the ATPase cytosolic domains have to reorganize before Ca2+ is released on the luminal side (McIntosh, Montigny et al. 2008). In all the above experiments, to estimate the free concentrations of divalent cations like calcium and magnesium, we had to take in account the possibility that anionic species present could chelate these cations. Using pH-meter techniques and metallochromic probes, we checked that the classical Mops buffer does NOT bind magnesium (Montigny and Champeil 2007), contrarily to what has been previously reported. In collaboration with colleagues from our lab, we also used similar techniques to characterize complex formation between cadmium (Cd2+) and reduced glutathion (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), a prerequisite for cadmium detoxification by cells. Abbreviations : ATPase, Adenosine TriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPAse, isoform 1a ; FITC, fluorescein isothiocyanate ; Mops, 4-morpholinopropanesulfonic acid.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumière du réticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures à résolution atomique de cette enzyme a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisées en absence de calcium avaient été obtenues en présence d'un inhibiteur fixé au domaine membranaire. Nous avons d'abord montré, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de protéolyse ménagée, que l'interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations présentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisées avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, en absence ou en présence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour protéger celle-ci de son éventuelle inactivation irréversible en présence de détergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des détergents communément utilisés pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple étude (Montigny, Arnou et al. 2008). En présence de glycérol, nous avons également pu étudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des états particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallèlement à ces études, nous avons élucidé le mystère des propriétés de fluorescence anormales d'une forme particulière de l'enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique. Nous avons mis en évidence une phosphorylation imprévue du FITC lié, conduisant à une très faible fluorescence, particulièrement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une réorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'étape de relargage des ions calcium vers la lumière du réticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos études, il nous a fallu évidemment tenir compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnésium, ...) par les anions présents. Par pH métrie et à l'aide de sondes colorées, nous avons vérifié que le magnésium n'était PAS chélaté par le tampon Mops classiquement utilisé, contrairement à ce qui était rapporté dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collègues du laboratoire, nous avons également précisé les différents complexes formés par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion réduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes étaient le plus susceptibles de se former au cours de la détoxication cellulaire du Cd2+. Abréviations : ATPase, AdénosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.

Mots clés: ATPase-Ca2+; fluorescence; détergent; protéine membranaire; expression hétérologue; cadmium

Mots clés: Ca2+-ATPase; membrane protein; heterologous expression

Domaines: Biochimie [q-bio.BM]

C. Montigny. Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae. Biochimie [q-bio.BM]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00430785v2⟩