Contrôle noradrénergique de la plasticité neurochimique et structurale dans le noyau supra-optique de l'hypothalamus chez la souris
Résumé
The magnocellular neurons of supraoptic nuclei (SON) participate in the synthesis and the release of vasopressin (AVP) and oxytocin (OT). This nucleus undergoes a reversible neurochemical and structural plasticity in response to physiological stimulations such as lactation, parturition and dehydration. Noradrenalin (NA) plays a critical role in this plasticity but the precise mechanisms of this regulation are not yet well elucidated. Indeed, many factors could be implicated in this regulation. Here we chose to study two of these factors: nitric oxide (NO) and metalloproteinases (MMP).
We used an ex-vivo model of hypothalamus slices (400µm) of C3H male mouse, containing the SON, maintained in an incubation chamber, under various pharmacological conditions. These slices underwent pharmacological treatments for 1h or 4h in the presence of NA. In order to determine the implication of NO or MMP in the NA signalling pathway;,treatments by L-arginine methyl ester (L-NAME, inhibitor of NO), sodium nitroprusside (SNP, donor of NO), the EGTA (inhibitor of Ca+2), and phenanthroline (inhibitor of MMP) were carried out. A quantification of the two peptides synthesized by magnocellular neurons under these conditions was carried out by enzymatic immuno-assay, and the study of the expression and the activity of the different peptides and factors were carried out by immunohistochemistry, histoenzymology, and in situ zymography.
In the first part of this work, we showed that NA stimulates the expression of AVP and OT validating thus our ex-vivo model. In parallel, an increase in the expression of nNOS and iNOS, and also in the activity of NADPH-diaphorase by NA was observed in the magnocellular neurons of the SON. No detection of eNOS was observed in the SON. Combining L-NAME to NA treatment, we showed that NO is implicated in the NA regulation of AVP but not that of OT. Using a blocker of the activity of nNOS we showed that NO implicated in the regulation of AVP by NA originated from nNOS and iNOS.
In the second part of this work, we showed that the neurochemical plasticity induced by NA could imply ECM molecules. We showed that MMP2 and MMP9 are expressed in vasopressin and oxytocin neurons and also in astrocytes. We then showed that NA increases the expression and the activity of these MMPs in magnocellular neurons of the SON. The implication of MMP2 and MMP9 in the regulation of the AVP and the OT by NA, realized by immunohistochemistry using an inhibitor of MMPs, demonstrated that these MMPs could be one of the factors implicated in the plasticity of the magnocellular neurons of SON.
We used an ex-vivo model of hypothalamus slices (400µm) of C3H male mouse, containing the SON, maintained in an incubation chamber, under various pharmacological conditions. These slices underwent pharmacological treatments for 1h or 4h in the presence of NA. In order to determine the implication of NO or MMP in the NA signalling pathway;,treatments by L-arginine methyl ester (L-NAME, inhibitor of NO), sodium nitroprusside (SNP, donor of NO), the EGTA (inhibitor of Ca+2), and phenanthroline (inhibitor of MMP) were carried out. A quantification of the two peptides synthesized by magnocellular neurons under these conditions was carried out by enzymatic immuno-assay, and the study of the expression and the activity of the different peptides and factors were carried out by immunohistochemistry, histoenzymology, and in situ zymography.
In the first part of this work, we showed that NA stimulates the expression of AVP and OT validating thus our ex-vivo model. In parallel, an increase in the expression of nNOS and iNOS, and also in the activity of NADPH-diaphorase by NA was observed in the magnocellular neurons of the SON. No detection of eNOS was observed in the SON. Combining L-NAME to NA treatment, we showed that NO is implicated in the NA regulation of AVP but not that of OT. Using a blocker of the activity of nNOS we showed that NO implicated in the regulation of AVP by NA originated from nNOS and iNOS.
In the second part of this work, we showed that the neurochemical plasticity induced by NA could imply ECM molecules. We showed that MMP2 and MMP9 are expressed in vasopressin and oxytocin neurons and also in astrocytes. We then showed that NA increases the expression and the activity of these MMPs in magnocellular neurons of the SON. The implication of MMP2 and MMP9 in the regulation of the AVP and the OT by NA, realized by immunohistochemistry using an inhibitor of MMPs, demonstrated that these MMPs could be one of the factors implicated in the plasticity of the magnocellular neurons of SON.
Les neurones magnocellulaires du noyau supraoptique (NSO) participent à la synthèse et la libération de la vasopressine (AVP) et de l'ocytocine (OT). Ce noyau subit une plasticité neurochimique et structurale réversible en réponse aux stimulations physiologiques telles que la lactation, la parturition et la déshydratation. La noradrénaline (NA) joue un rôle critique dans cette plasticité mais les mécanismes précis de cette régulation ne sont pas encore bien élucidés. En effet plusieurs facteurs moléculaires ou cellulaires pourraient être impliqués dans cette régulation. Dans le but d'étudier les facteurs impliqués dans la régulation de l'AVP et de l'OT par la NA, nous avons choisi de nous intéresser au monoxyde azote (NO) et aux métalloprotéinases (MMP).
Nous avons utilisé un modèle ex-vivo de tranches d'hypothalamus (400µm) de souris C3H mâle, contenant les NSO, maintenues en survie dans une chambre d'incubation, dans différentes conditions pharmacologiques. Ces tranches ont subi des traitements pharmacologiques pour 1h ou 4h en présence de la NA. Afin de déterminer l'implication du NO ou des MMP dans la voie de signalisation de la NA, des traitements par le L-arginine méthyl ester (L-NAME, inhibiteur de NO), le sodium nitroprusside (SNP, donneur de NO), l'EGTA (bloquer du Ca+2), et la phénanthroline (inhibiteur de MMP) ont été réalisé. Une quantification des deux peptides synthétisés par les neurones magnocellulaires dans ces conditions a été réalisée par le dosage immunoenzymatique, et l'étude de l'expression et de l'activité des différents peptides et facteurs a été réalisée par immunohistochimie, histoenzymologie, et zymographie in situ.
Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que la NA stimule l'expression de l'AVP et de l'OT validant ainsi notre modèle ex-vivo par rapport aux modèles in-vivo. Parallèlement, une augmentation de l'expression et de l'activité de la nNOS et la iNOS, ainsi que l'activité de la NADPH-diaphorase par la NA a été observé dans les neurones magnocellulaires du NSO. Aucune détection de la eNOS n'a été observée. L'utilisation de L-NAME au cours du traitement NA nous a permis de montrer que le NO est impliqué dans la voie de régulation de l'AVP par la NA mais pas dans celle de l'OT. L'analyse immunoenzymatique en utilisant un bloqueur de l'activité de la nNOS nous a permis de constater que le NO impliqué dans la régulation d'AVP par la NA provient à la fois de l'activité de la nNOS et de la iNOS.
Dans le deuxième partie, nous avons montré que la plasticité neurochimique induite par la NA pourrait impliquer des molécules de la MEC. Nous avons montré que la MMP2 et la MMP9 sont exprimées dans des neurones vasopressinergiques, ocytocinergiques, ainsi que dans les astrocytes. Nous avons ensuite montré que la NA augmente l'expression et l'activité de ces MMPs dans les neurones magnocellulaires du NSO. L'implication de la MMP2 et de la MMP9 dans la régulation de l'AVP et de l'OT par la NA, réalisée par immunohistochimie en utilisant un inhibiteur des MMPs, a permis de suggérer que ces MMPs pourraient être un des facteurs impliqués dans la plasticité des neurones magnocellulaires du NSO.
Nous avons utilisé un modèle ex-vivo de tranches d'hypothalamus (400µm) de souris C3H mâle, contenant les NSO, maintenues en survie dans une chambre d'incubation, dans différentes conditions pharmacologiques. Ces tranches ont subi des traitements pharmacologiques pour 1h ou 4h en présence de la NA. Afin de déterminer l'implication du NO ou des MMP dans la voie de signalisation de la NA, des traitements par le L-arginine méthyl ester (L-NAME, inhibiteur de NO), le sodium nitroprusside (SNP, donneur de NO), l'EGTA (bloquer du Ca+2), et la phénanthroline (inhibiteur de MMP) ont été réalisé. Une quantification des deux peptides synthétisés par les neurones magnocellulaires dans ces conditions a été réalisée par le dosage immunoenzymatique, et l'étude de l'expression et de l'activité des différents peptides et facteurs a été réalisée par immunohistochimie, histoenzymologie, et zymographie in situ.
Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que la NA stimule l'expression de l'AVP et de l'OT validant ainsi notre modèle ex-vivo par rapport aux modèles in-vivo. Parallèlement, une augmentation de l'expression et de l'activité de la nNOS et la iNOS, ainsi que l'activité de la NADPH-diaphorase par la NA a été observé dans les neurones magnocellulaires du NSO. Aucune détection de la eNOS n'a été observée. L'utilisation de L-NAME au cours du traitement NA nous a permis de montrer que le NO est impliqué dans la voie de régulation de l'AVP par la NA mais pas dans celle de l'OT. L'analyse immunoenzymatique en utilisant un bloqueur de l'activité de la nNOS nous a permis de constater que le NO impliqué dans la régulation d'AVP par la NA provient à la fois de l'activité de la nNOS et de la iNOS.
Dans le deuxième partie, nous avons montré que la plasticité neurochimique induite par la NA pourrait impliquer des molécules de la MEC. Nous avons montré que la MMP2 et la MMP9 sont exprimées dans des neurones vasopressinergiques, ocytocinergiques, ainsi que dans les astrocytes. Nous avons ensuite montré que la NA augmente l'expression et l'activité de ces MMPs dans les neurones magnocellulaires du NSO. L'implication de la MMP2 et de la MMP9 dans la régulation de l'AVP et de l'OT par la NA, réalisée par immunohistochimie en utilisant un inhibiteur des MMPs, a permis de suggérer que ces MMPs pourraient être un des facteurs impliqués dans la plasticité des neurones magnocellulaires du NSO.