Caractérisation enzymatique et biochimique du site actif de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase non-phosphorylante de Streptococcus mutans
Résumé
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Les aldéhyde déshydrogénases (ALDH) non-phosphorylantes à cofacteur NAD(P), coenzyme A (CoA) dépendantes ou non, forment une famille d'enzymes phylogénétiquement et structuralement distincte des ALDH phosphorylantes. Elles jouent un rôle essentiel au niveau cellulaire en intervenant notamment à différents niveaux du métabolisme cellulaire et dans des processus de détoxication. Ces enzymes catalysent la conversion d'aldéhydes en leurs acides correspondants (activés ou non par la CoA) par un mécanisme à deux étapes : une étape d'acylation incluant un processus d'oxydoréduction à transfert d'hydrure suivie d'une étape de désacylation. C'est dans ce cadre qu'une étude de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non-phosphorylante (GAPN), de Streptococcus mutans, enzyme non CoA dépendante impliquée dans la production d'équivalents réducteurs nécessaires au métabolisme de la bactérie avait été entreprise. Les facteurs moléculaires et structuraux impliqués dans la catalyse, notamment au niveau de l'étape d'acylation, et la spécificité structurale avaient été caractérisés. En particulier, le rôle essentiel des réarrangements conformationnels associés aux diverses étapes de la catalyse avait été montré. Une approche de relation structure/fonction combinant des approches biochimiques, moléculaires et structurales a permis de montrer que le groupement b-CH3 de la T244, résidu invariant dans les ALDH non CoA dépendantes, est essentiel au positionnement adéquat de la partie nicotinamide du cofacteur NADP au sein du complexe ternaire covalent hémithioacétal/NADP en vue de permettre un transfert d'hydrure efficace. La première structure d'un intermédiaire covalent thioacylenzyme pour l'ensemble de la famille des ALDH a également été obtenue et a permis de caractériser la conformation adoptée par le cofacteur réduit après le transfert d'hydrure. L'analyse de la structure de ce complexe covalent a permis de mettre en évidence un basculement important de la partie NMN réduite (NMNH) du cofacteur après l'étape d'acylation au niveau d'une cavité formée de résidus conservés et également retrouvée dans les autres structures connues d'ALDH non CoA dépendantes. Cette conformation de la partie NMNH est maintenant compatible avec une étape d'hydrolyse efficace. De plus, ce résultat est en accord avec le mécanisme cinétique des ALDH non CoA-dépendantes à savoir un mécanisme séquentiel ordonné dans lequel le cofacteur réduit est dissocié en dernier. Ce premier volet de mon projet a été mené en collaboration étroite avec l'équipe de Biocristallographie de Nancy (UMR CNRS-UHP 7036) Le second volet de mon projet avait pour objectif l'étude de l'influence de l'environnement protéique sur le positionnement et/ou l'activation du résidu E268, dont le rôle essentiel au niveau de l'étape d'hydrolyse avait été démontré. Pour ce faire, le rôle des résidus L174, L427, et F465, conservés voire invariants dans les ALDH non CoA dépendantes, a été étudié par mutagenèse dirigée. Les substitutions L174A et F465G se révèlent drastiques puisqu'elles conduisent à un changement d'étape limitante qui devient associée à l'acylation avec une constante de vitesse kac respectivement diminuée d'un facteur 320 et 105 par rapport au type sauvage. Ceci s'accompagne pour le mutant L174A d'une modification de la nature de l'étape limitante au sein de l'étape d'acylation qui n'est plus associée au transfert d'hydrure mais qui le précède. L'analyse de ces résultats combinée aux données structurales disponibles suggère un rôle des résidus L174 et F465 dans le positionnement adéquat de la chaîne latérale du résidu R459 pour permettre la formation d'un complexe ternaire GAPN/NADP/G3P efficace. Il suggère également leur contribution dans le positionnement de la chaîne latérale du résidu E268 en limitant sa liberté conformationnelle, alors que la contribution du résidu L427 serait mineure. Enfin, nous avons abordé une problématique plus générale dans le cadre des ALDH non phosphorylantes à savoir la caractérisation des facteurs moléculaires et structuraux impliqués dans les phénomènes de coopérativité pouvant exister dans ces enzymes multimériques. Nous avons montré l'existence de deux populations de sous-unités non équivalentes dans la GAPN de S. mutans. L'étude de l'étape d'acylation en cinétique rapide montre que pour deux sous-unités la vitesse associée à cette étape est nettement supérieure à 2500 s-1, alors qu'elle est de l'ordre de 800 s-1 pour les deux autres sous-unités. De plus, la substitution F465Y dans GAPN conduit à la perte des propriétés de coopérativité, les quatre sousunités devenant équivalentes avec une vitesse associée à l'étape d'acylation d'environ 120 s-1. L'inspection des alignements de séquences de l'ensemble des ALDH et des structures cristallines disponibles indique que ce résidu invariant est présent dans la boucle 453-467 localisée à l'interface monomère/monomère d'un même dimère. Le fait que cette boucle soit retrouvée dans toutes les structures cristallines d'ALDH non phosphorylantes suggère que l'expression des propriétés de coopérativité est liée à une conformation définie de cette boucle ou à une modification de sa conformation.
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Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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