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Université Pierre et Marie Curie - Paris VI (18/11/2011), Valérie Pichon (Dir.)
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Développement d'outils miniaturisés pour l'analyse de traces dans les matrices biologiques
Valérie Thibert1

L'analyse de traces dans les fluides biologiques est fréquemment précédée d'une étape d'extraction afin de limiter la présence d'interférents. Ainsi, l'extraction sur phase solide (SPE) est souvent utilisée en amont des techniques séparatives, mais son manque de sélectivité peut conduire à des co-extractions de composés interférents nuisant à l'analyse. L'utilisation d'outils basés sur une reconnaissance moléculaire tels que les immunoadsorbants (IS), utilisant des anticorps, ou les polymères à empreintes moléculaires (MIP) qui sont des polymères synthétiques avec des cavités complémentaires de la molécule empreinte en taille, forme et fonctionnalité, peut apporter de la sélectivité à l'analyse. La miniaturisation d'un système de séparation permet d'augmenter la sensibilité des analyses. Ainsi, le couplage d'une extraction miniaturisée sur MIP présente un intérêt par sa sélectivité. Celui-ci a donc été étudié pour l'extraction de la cocaïne et ses métabolites, la benzoylecgonine (BZE) et l'ecgonine méthylester (EME), comme molécules modèles, dans diverses matrices biologiques. Les performances d'une puce commerciale intégrant un canal d'enrichissement, un canal de séparation et une aiguille métallisée pour la formation d'un électrospray ont été initialement évaluées. La méthode d'analyse développée a montré d'excellents résultats en termes de sensibilité (limites de quantification de quelques dizaines de pg mL-1), et a donc été appliquée à l'analyse de traces de cocaïne et de BZE dans l'urine et les cheveux. Malgré les bons résultats obtenus, le manque de spécificité de l'étape d'extraction a finalement limité le potentiel de la méthode miniaturisée, d'où l'intérêt d'y intégrer un outil sélectif. Pour confirmer la faisabilité d'un MIP sélectif pour la cocaïne, des synthèses en format conventionnel ont été étudiées. Après optimisation de la synthèse et des protocoles d'extraction, une excellente sélectivité a été obtenue en milieu organique pour la cocaïne et ses métabolites. Cependant, en milieu hydro-organique ou aqueux pour la BZE n'a pas été retenue. Le MIP a par la suite été appliqué avec succès à l'extraction sélective de la cocaïne d'extraits de cheveux, de sérum et d'urine. Pour mettre à profit le potentiel sélectif du MIP pour les trois molécules ciblées, une étape préalable d'extraction liquide-liquide a été appliquée sur un échantillon urinaire, ce qui a permis de mettre de nouveau en évidence le potentiel du MIP pour la purification en milieu complexe. La dernière partie de ce travail a consisté à synthétiser un MIP sélectif pour la cocaïne dans un format miniaturisé. La première approche a reposé sur la synthèse de microparticules de MIP par précipitation. Plusieurs paramètres clés de la synthèse ont été étudiés afin d'obtenir des particules de NIP et de MIP de tailles proches de 3 μm. Malheureusement, le MIP ainsi obtenu ne s'est pas avéré sélectif vis-à-vis de la cocaïne et ses métabolites, ni dans un milieu organique ni dans un milieu aqueux. La deuxième approche a consisté en la synthèse de monolithes de MIP dans des capillaires de silice (100 μm d.i.). Divers paramètres ont été étudiés pour l'obtention d'un monolithe de MIP avec une morphologie appropriée au couplage avec la nanochromatographie en phase liquide. Le MIP ainsi sélectionné a présenté une meilleure affinité pour la cocaïne que le NIP correspondant en milieu acétonitrile, et sa synthèse s'est avérée répétable en termes de morphologie et de sélectivité. Un couplage a donc été effectué et, si ce dispositif nécessite encore une étude plus approfondie, des résultats très encourageants ont été obtenus pour l'extraction en ligne de la cocaïne d'échantillons urinaires dopés.
1:  PECSA - Physicochimie des Electrolytes, Colloïdes et Sciences Analytiques
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An initial extraction procedure is usually needed for the trace analysis of biological fluids to reduce the amount of interfering compounds. Thus, solid phase extraction (SPE) is often applied before the separation, but its lack of selectivity can lead to the co-extraction of interfering compounds compromising the analysis. In order to increase the selectivity of the analysis, selective tools, based on molecular recognition, can be used such as immunosorbents, using antibodies, or molecularly imprinted polymers (MIP). MIP are synthetic polymers possessing cavities which are complementary in size, shape and functionality of the imprint molecule. Sensitivity, speed and efficiency of the analysis can be improved by downscaling the separation system, therefore, miniaturization of the extraction with a MIP can be interesting to couple it with the separation on the same miniaturized device. MIP miniaturisation was thus studied for the extraction from biological matrices of cocaine and its main metabolites, benzoylecgonine (BZE) and ecgonine methyl ester (EME) as model molecules. The performances of a chip with an enrichment channel, a separation channel and a metalized nanospray tip were initially assessed. The optimized analysis method showed excellent results in terms of sensitivy (limits of quantification of a few pg mL-1). It was therefore successfully applied to cocaine and BZE trace analysis in urine and hair extracts. Nevertheless, the lack of selectivity of the SPE limited the potential of the chip analysis, stressing the need for the integration of a selective tool for the extraction. The feasibility of a MIP selective for cocaine and its metabolites was evaluated on a conventional format. After the optimization of the synthesis and the extraction protocol, an excellent selectivity was obtained in organic, hydro-organic and aqueous media for cocaine and EME, but BZE was not retained in aqueous and hydro-organic media. Selective cocaine extraction from hair extracts, serum and urine was successfully obtained. The MIP could not retain cocaine metabolites in serum, while a preliminary liquid-liquid extraction allowed their selective extraction from urine samples prior to analysis. The last part of this work was dedicated to the synthesis of a miniaturized cocaine-selective MIP. The first approach consisted in the synthesis of MIP microparticles by precipitation polymerization. Many synthesis key parameters were studied to obtain MIP and NIP microspheres of about 3 μm in diameter. Unfortunately, the obtained MIP microspheres were not selective for cocaine and its metabolites neither in organic nor in aqueous media. The second approach consisted of monolithic MIP synthesized in situ on silica capillaries (100 μm i.d.). Various parameters were studied to obtain a MIP monolith with a morphology appropriate to its coupling with liquid nanochromatography. The selected MIP exhibited a higher affinity for cocaine in organic media than the non imprinted polymer, and the synthesis was repeatable in terms of morphology and selectivity. The coupling was thus performed and, even though a deeper study of the device is necessary,very interesting results were obtained for the on-line extraction of cocaine from spiked urine samples.
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