Quantification of biomarkers of exposure to vesicant agents in easy to collect biological matrices.
Quantification de biomarqueurs d’exposition à des agents vésicants dans des matrices biologiques facilement accessibles
Résumé
Use of chemical warfare agents is a current concern shown in several recent conflicts (Iraq and Syria) and associated to terrorist threat. Availability of biomonitoring assays for the identification of toxic compounds and assessment of individual exposure is an important challenge. Sulphur mustard, a chemical warfare agents belonging to the vesicants family, and its analog CEES will be the focus of this PhD work. In the present work, we developed a sensitive non-invasive ultra-high-pressure liquid chromatography associated with tandem mass spectrometry approach (UHPLC-MS/MS) to quantify specific and persistent biomarkers. We also performed biological experiments, in vivo and in vitro, to validate their use as biomarkers. A DNA adduct, N7Guanine-CEES was detected, both in nuclear DNA and as depurinated base, in all biological experiments. In particular, in the plasma of mice, it is persistent until fourteen days. The glutathione conjugate, GSH-CEES, is short-lived and closed to the limit of detection because it is readily converted into the cysteine conjugate, Cys-CEES. The quantity of Cys-CEES is high compared to the other biomarkers but it could be tricky to analyse it because of its polar properties and the presence of interfering substances. Cys-CEES is converted into the mercapturate acid conjugate. NAC-CEES was detected in vivo in exposed mice but not in skin in vitro models. It is persistent at least for two weeks. The analytical method used for the CEES biomarkers was adapted for the sulphur mustard biomarkers and improved by an on-line Solid Phase Extraction (SPE). This validated method allows for detecting in human plasma biomarkers of sulphur mustard Cys-Yp, NAC-Yp and N7Gua-Yp in eleven minutes including the online SPE step. In summary, our work allowed us to validate new biomarkers of exposure to vesicants and provided information on the metabolism of these toxic agents.
Dans le domaine de la menace chimique l’un des principaux enjeux consiste à avoir accès à des méthodes de suivi biologique pour l’identification des toxiques et l’évaluation de l’exposition individuelle. L’ypérite (gaz moutarde), un toxique de guerre de la famille des vésicants, et son analogue le CEES seront au centre de cette thèse. Cette étude vise à mettre en place une méthode analytique spécifique à l’ypérite, sensible, capable de quantifier des biomarqueurs d’exposition persistants, présents dans les fluides biologiques et adaptés à une analyse par couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse (UHPLC-MS/MS). A travers diverses expérimentations biologiques, à la fois in vitro et in vivo, nous avons obtenus des résultats cohérents permettant de conclure sur la pertinence de certains biomarqueurs. L’adduit de l’ADN, N7Guanine-CEES, a été détecté pour tous les modèles utilisés. Dans le plasma de souris, il est persistant jusqu’à 14 jours. Le conjugué au glutathion, GSH-CEES, est éphémère et proche des limites de détection puisqu’il est rapidement transformé en conjugué à la cystéine, CYS-CEES. La quantité de Cys-CEES est élevée par rapport aux autres biomarqueurs quel que soit le modèle biologique mais son analyse est complexe de par son caractère polaire et la présence d’interférents. Ce conjugué est transformé en conjugué à l’acide mercapturique. NAC-CEES a été détecté que lors d’une exposition in vivo mais pas in vitro. Il est persistant pendant deux semaines. Une simple adaptation de la méthode analytique pour les biomarqueurs du CEES a été faite pour les biomarqueurs de l’ypérite en intégrant la SPE en ligne. Cette méthode validée permet de détecter rapidement dans le plasma humain les biomarqueurs de l’ypérite Cys-Yp, NAC-Yp et N7Gua-Yp. Notre travail a donc permis de valider de nouveaux biomarqueurs d’exposition aux vésicants et a apporté de informations sur le métabolisme de ces agents toxiques.
Origine : Version validée par le jury (STAR)