Characterization of a Novel Role of GNL3 in Maintaining Genomic Stability
Caractérisation d’un nouveau rôle de Gnl3 dans la maintenance de la stabilité de génome
Résumé
DNA replication requires a plethora of proteins to maintain its accuracy during replicative stress. In order to fully understand how DNA replication is sustained at proper pace, it is important to study the mechanisms that are guarding DNA replication during normal and perturbed conditions. Using the iPOND (isolation of proteins on nascent DNA) based screen we uncovered a new protein, GNL3 (aka nucleostemin), to be associated with replisome. GNL3 is overexpressed in several cancers and is involved in maintaining genomic integrity in stem and cancer cells, however its precise role(s) is unclear.One of the key mechanisms that protects the genomic stability during replication stress is the proper regulation of origin firing. In this project we show that GNL3 limits replicative stress by limiting replication origins firing. We proved that GNL3 is in in proximity of nascent DNA using different approaches and that its depletion reduces forks speed but increases forks density and replication origin firing. Conversely, overexpression of GNL3 leads to a decrease in origin firing. When subjected to exogenous replicative stress, cells impaired for GNL3 exhibits an increased MRN-dependent resection and RPA phosphorylation. Interestingly , we found that inhibition of origin firing using CDC7 inhibitor decreased resection in absence of GNL3 but not in absence of BRCA1, suggesting that GNL3 protects the integrity of stalled forks indirectly by regulating origin firing efficiency. In addition, using various approaches (BioID, PLA, coIP), we established that ORC2 and GNL3 interact together in the nucleolus. We propose that GNL3 level is crucial to determine the correct distribution of ORC2 on chromatin to regulate origins licensing. Our data present insights into a new role of GNL3 in the regulation of origin firing that protects genomic stability.
La réplication de l’ADN nécessite une pléthore de protéines afin d’assurer sa processivité en particulier en présence de stress réplicatif. . Afin de mieux comprendre le processus de réplication de l’ADN, il est important d’étudier les mécanismes qui permettent la réplication dans des conditions normales et en présence de stress réplicatif. A l’aide de la méthode iPOND (isolation of proteins on nascent DNA), nous avons découvert une nouvelle protéine associée avec la machinerie de réplication de l’ADN : GNL3 (appelée aussi nucleostemin). GNL3 est surexprimées dans plusieurs cancers et est impliquée dans la réponse aux lésions de l’ADN dans les cellules souches et cancéreuses, néanmoins ses fonctions précises au sein de la cellule ne sont pas connues.Un des mécanismes majeurs de la protection de l’intégrité du génome durant la réplication en présence de stress est le contrôle précis de l’activation des origines de réplication. Durant ma thèse de Doctorat j’ai montré que GNL3 limite le stress réplicatif en contrôlant l’activation des origines de réplication. J’ai montré que GNL3 est à proximité de l’ADN naissant en utilisant plusieurs approches et que sa déplétion réduit la vitesse de progression des fourches de réplication tout en augmentant la leur densité et l’activation de origines de réplication. Inversement, la surexpression de GNL3 inhibe l’activation des origines de réplication. En présence de sources exogènes de stress réplicatif, l’inactivation de GNL3 conduit à une résection de l’ADN naissant par le complexe MRN et à un la phosphorylation de RPA. J’ai montré que l’inhibition de l’activation des origines de réplication (en utilisant un inhibiteur de CDC7) conduit à une baisse du niveau de résection en absence de GNL3 mais pas en absence de BRCA1. Il apparait donc que GNL3 joue un rôle clé dans la stabilité des fourches de réplication bloquées en régulant l’efficacité d’activation des origines. De plus, à l’aide de plusieurs approches (BioID, PLA, CoIP), j’ai établi que GNL3 interagit avec ORC2 dans le nucléole. Je propose que GNL3 joue un rôle clé dans la distribution d’ORC2 sur la chromatine permettant ainsi la régulation correcte de l’activation des origines. Au final il apparait que le rôle de GNL3 dans la régulation des origines est crucial pour assurer la stabilité du génome.
Origine : Version validée par le jury (STAR)