High resolution characterization of human erythroid progenitor’s heterogeneity : implications for understanding physiological and pathological erythropoiesis.
Caractérisation à haute résolution de l'hétérogénéité des progéniteurs érythroïdes humains : implications dans la compréhension des érythropoïèses physiologique et pathologique
Résumé
Erythropoiesis is a process by which red blood cell are produced from hematopoietic stem cell present in the bone marrow. It is a complex process subject to tight regulation, which could be divided into three successive phases: early erythropoiesis, terminal erythroid differentiation (TED), and reticulocyte maturation. Of those three phases, early erythropoiesis is the least well characterized and the heterogeneity of erythroid progenitors remains to be better characterized. This thesis presents the results of two paralleled studies that center around the characterization and regulation of erythroid progenitors in normal and disordered human erythropoiesis, in the form of published articles. In article 1, we explored the mechanism of action of glucocorticoids in the erythroid lineage and steroid resistance in patients with Diamond Blackfan anemia (DBA). As one of the main therapeutic options for treatment of patients with DBA, the effect of glucocorticoids in promoting erythropoiesis is well known, but the underlying mechanism remains elusive. We found that dexamethasone, a synthetic glucocorticoid, enhanced the erythroid proliferation of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) derived from peripheral blood (PB) but not cord blood (CB). By resolving the heterogeneity of a progenitor population predominating in PB but not CB, we identified an immature CFU-E population CD71hiCD105med as the principal target of dexamethasone. Proteomics analysis revealed specific up-regulation of several cell cycle regulators in PB derived cells treated with dexamethasone including p57kip2, a Cip/Kip cyclin-dependent kinase inhibitor. Consistent with a recent study, we observed a significant decrease of S-phase cells in PB derived immature CFU-Es treated with dexamethasone and down-regulation of p57kip2 significantly attenuated the effect of dexamethasone. Importantly, dysregulated expression of p57kip2 was observed in erythroid progenitors from DBA patients with steroid resistance. Altogether, these data suggested that dexamethasone specifically induces expansion of immature CFU-Es CD71hiCD105med through a conserved role of p57kip2 in negative regulation of cell cycle in murine and humans.In the paralleled study presented in article 2, we further delineated the heterogeneity of erythroid progenitors through comprehensive immunophenotyping on the continuum of early erythropoiesis in human bone marrow. Using the two surface markers used in the above study, CD71 and CD105, we divided erythroid progenitor populations previously defined by IL3R, GPA, CD34 and CD36 into more subsets and performed functional characterization on these subsets. On this basis, we dissected the erythroid progenitor continuum into four distinct populations, EP1, EP2, EP3 and EP4. Moreover, we demonstrated that the marked decrease of CD105 expression during TED could discriminate the five stages of erythroblasts including pro-erythroblast, early and late basophilic erythroblast, poly- and ortho-chromatic erythroblasts. Thus, we developed an efficient flow cytometry-based strategy for stage-wise detection of erythroid differentiation from the BFU-E stage to the reticulocyes. Applying this strategy to primary bone marrow cells from patients with myelodysplastic syndrome (MDS), we identified previously unrecognized defects at varied stages of erythroid progenitors.Taken together, the findings delineated the heterogeneity of erythroid progenitors at a better resolution, and demonstrated the mechanism of current therapeutic drug for treatment of DBA, contributing to a better understanding of erythroid progenitor biology in the context of normal and disordered erythropoiesis.
L'érythropoïèse est un processus qui permet la production de globules rouges à partir de cellules souches de la moelle osseuse. Ce processus complexe finement régulé est généralement divisé en 3 phases successives : l'érythropoïèse précoce, la différenciation érythroïde terminale (TED) et la maturation réticulocytaire. La première phase est la moins bien définie ; l'hétérogénéité des progéniteurs érythroïdes restant à être mieux caractérisée. Cette thèse à articles présente 2 études centrées sur la caractérisation et la régulation des progéniteurs érythroïdes dans l'érythropoïèse humaine normale et pathologique. Nous avons d’abord exploré le mécanisme d'action des glucocorticoïdes dans la lignée érythroïde et la résistance aux stéroïdes chez les patients atteints de l’anémie de Diamond-Blackfan (ADB). Les glucocorticoïdes sont une des principales options thérapeutiques pour traiter ces patients et leur effet dans l’activation de l'érythropoïèse est bien connu. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacent restent encore relativement incompris. Nous avons découvert que la dexaméthasone (dex), un glucocorticoïde synthétique, augmente la prolifération érythroïde des cellules souches/progénitrices CD34+ dérivées de sangs périphériques d’adultes (SPA), mais pas celles de sangs de cordon (SC). En décryptant l'hétérogénéité d'une population de progéniteurs prédominant uniquement dans les SPA, nous avons identifié une population immature de CFU-E CD71hiCD105med comme principale cible de la dex. L'analyse protéomique a révélé une augmentation spécifique de l’expression de régulateurs du cycle cellulaire dans les CD34+ dérivées de SPA traités avec la dex, notamment du facteur p57kip2, un inhibiteur de la kinase cycline-dépendante Cip/Kip. En accord avec une étude récente, nous avons observé une diminution significative des cellules en phase S dans les CFU-E immatures dérivées de SPA traités avec la dex et avons montré que la diminution de l’expression de p57kip2 atténuait de manière significative l'effet de la dex. De plus, l'expression dérégulée de p57kip2 a été observée dans les progéniteurs érythroïdes de patients ADB présentant une résistance aux stéroïdes. Ces données suggèrent que la dex induit spécifiquement l'expansion des CFU-E immatures CD71hiCD105med par le biais d'un rôle de p57kip2 conservé dans la régulation négative du cycle cellulaire.Nous avons ensuite décrit l'hétérogénéité des progéniteurs érythroïdes via un immunophénotypage caractérisant le continuum des progéniteurs érythroïdes précoces dans la moelle osseuse humaine. En utilisant les marqueurs de surface CD71 et CD105, nous avons divisé les populations de progéniteurs érythroïdes précédemment définies par IL3R, GPA, CD34 et CD36 en sous-groupes et avons effectué leur caractérisation fonctionnelle. Ainsi, nous avons disséqué le continuum des progéniteurs érythroïdes en 4 populations distinctes : EP1, EP2, EP3 et EP4. De plus, nous avons montré que la diminution marquée de l'expression de CD105 pendant la TED pouvait discriminer les 5 stades d'érythroblastes : les pro-érythroblastes, les érythroblastes basophiles précoces et tardif ainsi que poly- et ortho-chromatiques. Cette stratégie permet ainsi la détection plus fine des étapes de la différenciation érythroïde allant du stade BFU-E aux réticulocytes. En appliquant cette stratégie expérimentale à des cellules de moelle osseuse provenant de patients atteints du syndrome myélodysplasique (SMD), nous avons identifié des défauts non encore identifiés à divers stades des progéniteurs érythroïdes.Ainsi, mes résultats ont permis de définir avec une meilleure résolution l'hétérogénéité des progéniteurs érythroïdes ainsi que de mieux comprendre le mécanisme d’action de la dex dans le traitement de l'ADB, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de la biologie des progéniteurs érythroïdes dans le contexte des érythropoïèses normale et pathologique.
Origine : Version validée par le jury (STAR)