Development of an enzymatic assay on biochip measuring DNA double strand breaks repair capacity : biological validation and applications
Développement d'un test de mesure de réparation des cassures double-brin de l'ADN sur biopuce : validations biologiques et applications
Résumé
Human cells are under constant threat from DNA-damaging agents. Double-strand breaks (DSBs) are highly deleterious DNA lesions that can induce chromosomal translocations, increase mutation rate and participate in malignant transformation. DSBs are also induced by standard anticancer treatments, in order to trigger cell death mechanisms in cancerous cells. In humans, DSBs are processed by complex repair systems that operate with different speed and fidelity. The last two decades saw the emergence of several repair inhibitors that target major repair pathways and reduce repair capacity in tumor cells. A better understanding of DSB repair processes would improve the identification of tumors that could respond to repair inhibitors. In addition, it may also allow the identification of specific repair profiles associated with an increased risk of treatment-induced adverse effects. Thus, functional approaches allowing the characterization of DSB repair profiles could complement current genotyping methods.In this intent, LXRepair developed a multiplexed assay on biochip that allows the analysis of several DSB repair activities. Repair profiles have been characterized in three human cancer cell lines as part of technical and biological assay validations. Repair activities were studied both at the basal level and following exposure to DSB-inducing chemical doxorubicin, combined or not with various repair inhibitors. In collaboration with the CIBEST team, results were compared to a reference assay based on agarose gel electrophoresis. In addition, 53BP1 foci and repair protein levels or activity were investigated, together with the activity of repair pathways that process lesions other than DSBs, allowing further characterizations of the cellular response to the treatments. This study highlighted the interest of the biochip approach compared to the chosen reference method, both from the technical and biological perspective. The assay reduced experimental workload while providing information on several repair pathways simultaneously. However, this work also reflects the complexity of the regulation of DNA repair systems and raises a set of questions that call for further investigation. Overall, the results obtained within the course of this project highlight the potential of the biochip method for various applications in oncology, fundamental research or biomolecular screening.
Les cellules humaines sont constamment exposées à des facteurs divers qui endommagent leur ADN. Les cassures double-brin (CDB) comptent parmi les lésions de l’ADN les plus délétères ; elles peuvent induire des translocations chromosomiques, augmentent le risque de mutation et participent à la transformation en cellules cancéreuses. Des CDB sont d’autre part induites par les agents anticancéreux les plus courants, qui visent à déclencher la mort cellulaire dans les cellules tumorales. Chez l’Homme, ces lésions sont prises en charge par des mécanismes complexes de réparation qui opèrent de manière plus ou moins rapide et fidèle. Le développement d’inhibiteurs de réparation a permis de bloquer des mécanismes-clé et de diminuer la capacité de réparation des cellules tumorales. Une compréhension plus complète des mécanismes de réparation des CDB permettrait d’une part de mieux identifier les tumeurs susceptibles de répondre à des inhibiteurs de réparation et pourrait d’autre part permettre d’associer des profils de réparation spécifiques à une susceptibilité accrue de développer des effets indésirables liés aux traitements. Des méthodes fonctionnelles permettant de caractériser des profils de réparation pourraient ainsi compléter les techniques actuelles de génotypage.Dans cette optique, l’entreprise LXRepair a développé une méthode multiplexée sur biopuce permettant d’étudier la réparation des CDB via différentes voies. Dans le cadre de l’optimisation technique et biologique de ce test, les profils de réparation de plusieurs lignées cancéreuses humaines ont été comparés en l’absence de traitements et suite à une exposition à un composé génotoxique, la doxorubicine, combiné ou non à des inhibiteurs de réparation. En collaboration avec l’équipe CIBEST, les résultats obtenus ont été comparés à une approche de référence fondée sur l’électrophorèse sur gel d’agarose. En parallèle, la quantification de foci 53BP1, la mesure de l’abondance et de l’activité de protéines de réparation des CDB ainsi que l’étude de l’activité de voies de réparation d’autres lésions à l’ADN ont permis de mieux caractériser la réponse des modèles cellulaires aux différents traitements. Cette étude a mis en évidence l’intérêt de l’approche sur biopuce par rapport à la méthode de référence, aussi bien sur des aspects techniques (réduction du temps d’analyse par échantillon) que biologiques (caractérisation de plusieurs mécanismes de réparation simultanément). Cependant, les profils de réparation obtenus soulignent la complexité de la régulation de la réparation de l’ADN, ce qui soulève de nouvelles pistes de recherches. Dans l’ensemble, les résultats obtenus au cours de ce projet mettent en évidence l’intérêt la méthode sur biopuce, qui trouve des applications directes en oncologie, en recherche fondamentale ou en criblage biomoléculaire.
Origine : Version validée par le jury (STAR)