Quantitative analysis of morphology of fishes on juvenil and larval stages
Analyse morphométrique du cerveau de poisson zèbre : mise en place de procédures d'imagerie et de segmentations rapides
Résumé
In recent years, zebrafish have become well established for the study of fundamental biology, toxicology and drug discovery. Here we propose fast, standardized protocols for high-throughput and high-content 3D imaging of 5dpf zebrafish fry using a confocal laser scanning microscope. Using a lipophilic fluorescent dye, we generated a reference labeling in cleared fish. We developed a mounting method based on 3D-printed stamps used to create a grid of wells in an agarose cast. We demonstrate that the quality and homogeneity of the fluorescence signal allows an unequivocal segmentation of the whole specimen and the white matter. From there, we built an automated image registration and analysis pipeline for the volumetric analysis of morphological defects. The platform, termed ‘ZeBraInspector’, is focused on the analysis of the shape of the whole fry or the white-matter of the central nervous system. We finally provide two examples of application: the characterization of a phenotype associated with a neuro-developmental mutation, and of the defects caused by treatments with a toxic anti-cancer compound. ZeBraInspector can be adapted to a wide variety of high-content analyses.
L’observation d’organismes vivants par microscopie est d’un intérêt scientifique indéniable. Le poisson zèbre est un modèle de choix pour tirer le meilleur de ces observations, sa transparence pouvant être améliorée par des méthodes de clarification de tissus. L’objectif de ma thèse a été de développer un ensemble de méthodes permettant la mise au point une plateforme d’analyse à haut débit. Toutes les étapes ont été considérées : préparation et montage des échantillons, optimisation des acquisitions, développement de méthodes d’analyse des images 3D. Cette plateforme permet d’observer une centaine d’échantillons alignés par recalage de l’axe interoculaire. La segmentation de l’alevin et d’une partie de son cerveau permet l’analyse volumétrique des différentes structures. La capacité de cette méthode a été testée avec deux projets à portée biomédicale : l’étude de mutants possédant des défauts neurodéveloppementaux et l’effet tératogène de traitements anticancéreux. Nous avons montré que la plateforme permet l’obtention de résultats précis par la volumétrie. Cette plateforme et les résultats associés ont fait l’objet d’une publication. Au cours de ma thèse, je me suis aperçu des limites des méthodes de clarification. J’ai donc développé un algorithme de correction du contraste publié dans un second article. Je suis convaincu que mon travail de thèse va offrir à la communauté poisson zèbre comme à d’autre communauté un nouvel outil permettant d’analyser de nombreux processus biologiques à grande échelle et avec une très forte résolution. Des applications supplémentaires sont discutées dans la partie perspectives de ma thèse
Origine : Version validée par le jury (STAR)