Regulation of gene expression by the transcription factor SPI-1/PU.1 in erythroleukemia : mechanisms of gene repression by its binding to DNA, consequences of its binding to RNA
Régulation de l’expression génique par le facteur de transcription SPI1/PU.1 dans l’érythroleucémie : mécanismes de répression des gènes par sa liaison à l’ADN, conséquences de sa liaison à l’ARN
Résumé
SPI1/PU.1 is a transcription factor belonging to the ETS family characterized by a highly conserved DNA binding domain (ETS domain) and a common core binding the 5’-GGAA/T-3’ DNA sequence. SPI1 is a key regulator of haematopoiesis, the regulation of SPI1 expression and function depends on lineage. Deregulation of Spi1 expression or activity contributes to hemopathies; SPI1 behaves as an oncogene or a tumor suppressor according to the hematopoietic lineage. SPI1 has been shown to be oncogenic in Waldenström’s macroglobulinemia, pediatric T cell acute lymphoblastic leukemia and erythroleukemia. Acute erythroid leukemia is a rare but high-risk leukaemia of poorly understood genetic basis. In the murine erythroid lineage, SPI1 abnormal unrestrained expression leads to acute leukemia, in part by inhibiting erythroid differentiation and apoptosis of erythroid progenitors.SPI1 is a transcription factor that also affects splicing processes. The ways SPI1 activates gene expression are now mostly established. As a pioneering transcription factor, SPI1 is able to bind closed chromatin and then to recruit many epigenetic and/or lineage specific co- or transcriptional factors. In contrast, Spi1 repressive functions on gene expression remain poorly understood. Whether it acts through its ability to bind DNA and/or RNA is not known. My PhD thesis is dedicated to the characterization of the mechanisms by which SPI1 represses gene expression. In particular, I studied how SPI1 represses gene expression in a model of murine erythroleukemia by investigating the role of SPI1 on epigenetic modifications. I also investigated the consequences of SPI1 binding to RNA. Using pre-leukemic cells issued from Spi1 transgenic mice, cells in which spi1 expression can be controlled (overexpressed or down-regulated), I performed an integrated analysis of several high throughput sequencing data sets to characterize epigenetic histone modifications, chromatin accessibility and gene expression. In order to compare histone modification signals from different conditions, we developed an R package, named ChIP-seq Inter-sample Normalization (CHIPIN). The algorithm of CHIPIN is based on the biological assumption that genes with constant expression across conditions have, on average, similar “true” ChIP-seq binding intensities. Using bioinformatic analysis combined with biological experiments, we demonstrate that SPI1 gene repression activity was based on the coordination of two mechanisms that involved and are controlled by histone deacetylase 1 (HDAC1) and polycomb repressive complex 2 (PRC2). Repressed genes include genes coding for apoptosis and erythroid differentiation. Finally, I studied the landscape of SPI1 binding on RNA using CLIP-seq data and showed that SPI1 binding on RNA was not related to gene expression regulation. Thus, the role of SPI1 when it binds RNA is not fully explain, even if we showed that SPI1 binds mainly in intronic regions on RNA. To sum up, my work highlighted new mechanisms for gene repression regulation by SPI1 in erythroleukemia in cooperation with two epigenetics factors: PRC2 and HDAC1. This work provides new insights in the role of the major hematopoietic regulator SPI1 for gene repression mechanisms. In addition, part of my work was dedicated to develop an R package called CHIPIN allowing for normalization of ChIP-seq signals from several conditions or samples. This method can be also used for ATAC-seq data. The R package is user friendly and can therefore be used by both bioinformaticians and biologists.
SPI1/PU.1 est un facteur de transcription de la famille ETS, cette famille est caractérisée par un domaine de fixation à l’ADN très conservé (domaine ETS) et un noyau de fixation commun : la séquence 5’-GGAA/T-3’. C’est un régulateur clé de l’hématopoïèse dont la régulation de l’expression et la fonction dépendent du lignage. La dérégulation de l’expression de spi1 ou de son activité contribue à des hémopathies, il peut se comporter comme un oncogène ou comme un suppresseur de tumeur selon les lignages. Dans différentes pathologies, la macroglobulémie de Waldenström, la leucémie aïgue lymphoblastique à cellules T pédiatrique et dans l’érythroleucémie, SPI1 se comporte comme un oncogène. Les leucémies aïgues érythroïdes sont des leucémies rares mais à haut risque et dont les bases génétiques sont mal connues. Dans le lignage érythroïde, une expression anormale et non-contrôlée de SPI1 entraîne une leucémie aiguë, en partie en inhibant la différenciation érythroïde et l'apoptose des progéniteurs engagés dans la différenciation érythroïde. SPI1 est un facteur de transcription dont les fonctions les plus connues et les mieux établies concernent l’activation de l’expression génique. C’est un facteur de transcription pionnier qui est capable de se fixer sur de la chromatine non-accessible afin de recruter des facteurs épigénétiques, des (co-)facteurs ou des facteurs de transcription spécifiques de lignage. Il a également une fonction dans l’épissage de l’ARN. En revanche, les fonctions répressives de SPI1 sont très peu connues, en effet on ne sait pas si ces fonctions sont liées à sa capacité à lier l’ADN et/ou l’ARN. Mon travail de thèse concerne la caractérisation des mécanismes par lesquels SPI1 réprime l’expression génique dans un modèle d’érythroleucémie murine. J’ai étudié son implication dans les modifications épigénétiques ainsi que les conséquences de sa fixation à l’ARN. En utilisant des cellules pré-leucémiques issues de souris transgéniques pour spi1, dans lesquelles l’expression de spi1 peut être contrôlée (sur-exprimée ou réprimée), j’ai comparé des données de séquençage à haut débit pour caractériser l’accessibilité de la chromatine, les modifications épigénétiques des protéines histones et l’expression des gènes en fonction de la présence ou de l’absence de SPI1. Pour comparer les signaux de ChIP-seq entre différentes conditions, nous avons développé un package R : ChIP-seq Intersample Normalization (CHIPIN) dont l’algorithme est basé sur l’hypothèse biologique selon laquelle les gènes dont l’expression est constante entre les conditions, ont, en moyenne, des intensités de ChIP-seq similaires. Nous avons ainsi démontré que la répression des gènes par SPI1, dont certains sont liés à la différenciation érythroïde et à l’apoptose, est basée sur la coordination de deux mécanismes qui impliquent et sont contrôlés par l’histone dé-acétylase 1 (HDAC1) et le complexe répressif Polycomb (PRC2). J’ai également caractérisé la fixation de SPI1 à l’ARN en utilisant des données de CLIP-seq et démontré que cette fixation à l’ARN n’était pas liée à la régulation de l’expression génique. Ainsi, le rôle exact de la fixation de SPI1 à l’ARN n’est pas encore totalement expliqué, même si nous avons pu montrer que SPI1 se fixait majoritairement dans des régions introniques. Mes travaux de thèse ont donc permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes, jusqu’ici inconnus, pour la répression de l’expression génique par SPI1 dans l’érythroleucémie en coopération avec deux facteurs épigénétiques : PRC2 et HDAC1. De plus, une partie de mon travail de thèse a été dédié au développement d’un nouveau package R pour la normalisation de signaux de ChIP-seq entre différentes conditions ou échantillons. Cette méthode peut également être appliquée à des données d’ATAC-seq, elle est facile d’utilisation et peut ainsi être mise en oeuvre par les bioinformaticiens mais aussi par les biologistes.
Origine : Version validée par le jury (STAR)