Impact of the hemagglutinin/neuraminidase balance on co-infection frequency of influenza A viruses and consequences of influenza A and B heterotypic co-infections
Effet de la balance hémagglutinine/neuraminidase sur la fréquence de co-infections chez les virus influenza A et impact des co-infections hétérotypiques entre virus influenza A et B
Résumé
Influenza A (IAV) and B (IBV) viruses belong to the Orthomyxoviridae family. The genome is composed of eight negative single-stranded RNA segments. The IAV and IBV viruses are responsible for seasonal influenza epidemics in humans. Upon co-infection of a cell with different subtypes of IAV virus, the segmented nature of the genome leads to the formation of "reassortant viruses" whose genome is composed of a mixture of parental genomic segments and may have pandemic potential. Co-infections therefore play a major role in the evolution of influenza viruses allowing genetic reassortment but also by promoting genetic complementation between viral particles, thus increasing the diversification of the viral population. Mechanisms allowing or limiting co-infections events have been described for many viruses but are not widely understood for influenza viruses. The first objective of my PhD was the optimization of a probabilistic system allowing the quantification of homotypic co-infection events between IAV viruses by flow cytometry. The second objective was to use this system to measure the impact of the balance between the activities of the two surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), on the frequency of co-infections. Finally, the third objective was to measure the impact of IAV and IBV heterotypic coinfections on the replicative capacities of IAV and IBV. The co-infection events were quantified by flow cytometry using couples of recombinant influenza viruses in which each partner virus expresses a different fluorescent reporter, mCherry or GFP. Two couples with ditinct balanced HA / NA balances were produced and characterized in order to measure the impact of the HA / NA balance on the level of aggregation of viral particles and therefore on the frequency of co-infections. Briefly, cells were co-infected with equivalent amounts of virus within each couple, fluorescence was then measured by flow cytometry, and data were analyzed using the optimized probabilistic model. The implementation of the probabilistic model makes it possible to include seven combinations of aggregations and one hundred and seventy-one combinations between viral particles and aggregates resulting in co-infection. We have shown that the HA / NA balance does not affect the frequency of co-infections in IAV viruses under the conditions tested. A trend was however observed with a slight increase in the frequency of co-infections for the condition where the NA activity was lower. Too low neuraminidase activity could increase the number of aggregates between viral particles by preventing dissociation between virions, thus inducing an increase in co-infections. To study the effect of heterotypic infections between IAV and IBV, we used an IAV expressing GFP and an IBV expressing mCherry. We have shown that prior infection of A549 cells with the IAV increases the susceptibility of cells to infection with the IBV. The proportion of cells infected with the IBV is also increased in co-infected cells. The work detailed in this thesis manuscript presents the optimization of a robust system for measuring the frequency of co-infections in influenza A viruses by flow cytometry. This system could be used to measure the effect of many cellular and viral factors on the frequency of co-infections for IAV or other viruses. The characterization of the mechanisms involved in the increase in cellular sensitivity to IBV infection following an IAV infection could provide a better understanding of heterotypic influenza virus co-infections.
Les virus influenza A (IAV) et B (IBV) sont des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae dont le génome est composé de huit segments d'ARN monocaténaires de polarité négative. Les virus IAV et IBV sont responsables des épidémies saisonnières de grippe chez l'Homme. Lors de la co-infection d'une cellule par différents sous-types de virus IAV, la nature segmentée du génome mène à la formation de « virus réassortants » dont le génome est composé d'un mélange des segments parentaux et pouvant avoir un potentiel pandémique. Les co-infections jouent donc un rôle majeur dans l'évolution des virus influenza en permettant la réalisation de réassortiments mais également en favorisant la complémentation génétique entre particules virales, augmentant ainsi la diversification de la population virale. Des mécanismes permettant de favoriser ou de limiter les co-infections ont été décrits pour de nombreux virus mais sont largement méconnus pour les virus influenza. Le premier objectif de ces travaux de thèse a été d'optimiser un système probabilistique permettant la quantification des évènements de co-infections homotypiques entre virus IAV par cytométrie en flux. Le second objectif a été d'utiliser ce système pour mesurer l'impact de la balance entre les activités des deux glycoprotéines de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), sur la fréquence de co-infections. Enfin, le troisième objectif a été de mesurer l'incidence des coinfections hétérotypiques sur les capacités réplicatives des virus IAV et IBV. Les évènements de co-infection ont été quantifiés par cytométrie en flux en utilisant des couples de virus influenza recombinants dont chaque partenaire exprime un rapporteur fluorescent différent, mCherry ou GFP. Deux couples possédant des balances HA/NA plus ou moins équilibrées ont été produits et caractérisés afin de mesurer l'impact de la balance HA/NA sur le degré d'agrégation des particules virales et donc sur la fréquence de co-infections. Brièvement, des cellules ont été co-infectées par des quantités équivalentes de virus au sein de chaque couple, la fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux et les données ont été analysées à l'aide du modèle probabilistique optimisé. L'implémentation du modèle probabilistique permet d'inclure sept combinaisons d'agrégations et cent-soixante et onze combinaisons entre particules virales et agrégats aboutissant à une co-infection. Nous avons montré que la balance HA/NA n'affectait pas la fréquence de co-infections chez les virus IAV dans les conditions testées. Une tendance a cependant été observée avec une légère augmentation de la fréquence de co-infections pour la condition où l'activité NA est plus faible. Une activité trop faible de la neuraminidase pourrait augmenter le nombre d'agrégats entre particules virales en empêchant la dissociation entre les virions, induisant ainsi une augmentation des co-infections. Pour étudier l'effet des infections hétérotypiques entre virus IAV et IBV, nous avons utilisé un virus IAV exprimant la GFP et un virus IBV exprimant la mCherry. Nous avons montré que l'infection préalable de cellules A549 par le virus IAV augmentait la sensibilité des cellules à l'infection par le virus IBV. L'intensité de l'infection par le virus IBV est également augmentée dans les cellules co-infectées. Ces travaux de thèse ont permis d'optimiser un système robuste de mesure de la fréquence de co-infections chez les virus influenza A par cytométrie en flux. Ce système pourrait être utilisé pour mesurer l'effet de nombreux facteurs cellulaires et viraux sur la fréquence de co-infections chez les virus IAV ou d'autres virus. La caractérisation des mécanismes impliqués dans l'augmentation de la sensibilité cellulaire à l'infection par IBV suite à une infection par IAV pourrait permettre de mieux comprendre les co-infections hétérotypiques chez les virus influenza.
Origine : Version validée par le jury (STAR)