Implication of cholesterol metabolism in spinal muscular atrophies pathogenesis
Étude de l’implication du métabolisme du cholestérol dans la pathogénèse des amyotrophies spinales infantiles
Résumé
Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive rare disease occurring in childhood for which no therapy is efficient. SMA is characterized by specific degeneration of motor neurons causing critical muscle weaknesses which, when they affect the respiratory muscles, cause death of the patients. The origin of these diseases is the mutation of the Survival of Motor Neuron 1 (Smn1) gene that induces a Survival of Motor Neuron (SMN) protein deficiency. All patients with SMA have at least 2 copies of the Smn2 gene, which modulates the severity of the disease by producing a small amount of complete SMN proteins. Indeed, due to the alternative splicing of the exon-7 which codes for a stability domain of the SMN protein, the transcripts produced by Smn2 expression are in most cases incomplete, and generate unstable SMN proteins, that are rapidly degraded. Thus, a major therapeutic objective in SMA is to increase the levels of SMN proteins in patients. By decrypting the molecular mechanisms underlying the beneficial effects of physical exercise in a severe SMA mouse model, the laboratory has shown that a direct stimulation of NMDA receptors (NMDAR) leads to a significant increase in the inclusion of the exon 7 in the SMN transcripts generated from the expression of the Smn2 gene in SMA tissues. In my thesis, I contribute to the identification of a second mechanism induced by exercise, related to the reduction of the expression levels of the IGF-1 receptor (IGF-1R), which is overexpressed in the spinal cord of SMA mice. The reduction of IGF-1R is sufficient to promote the expression of SMN, both at transcriptional and post-transcriptional levels. Using a transcriptomic approach to identify genes whose expression is similarly modified by NMDAR or IGF-1R modulation, we identified a set of genes that belongs to the cholesterol biosynthesis pathway. RT-qPCR and western blot analyzes in the spinal cord of mice controls and SMA models revealed that i) the enzymes of the cholesterol biosynthesis pathway are under-expressed in the spinal cord of SMA mice and in a culture Fibroblasts from SMA patients and ii) NMDA treatment or reduction of IGF-1R reactivates the expression of cholesterol biosynthesis pathway enzymes at levels comparable to controls. Importantly, we have demonstrated that the specific inhibition of DHCR24, a key enzyme of the cholesterol biosynthesis terminal pathway, in control fibroblasts induces a significant reduction in SMN expression, both at the level of MRNA and protein and that conversely, restoration of DHCR24 expression levels in human SMA fibroblasts induces a significant increase in SMN expression. In addition, GC-MS quantification of cholesterol, its metabolites, and various oxysterols indicates that the entire cholesterol metabolism is altered in the spinal cord of SMA mice and enhanced by NMDAR activation. All these results show for the first time that cholesterol homeostasis is disturbed in SMAs and that to modulate the molecular pathways dependent on cholesterol and its derivatives can constitute a promising therapeutic approach.
Les amyotrophies spinales infantiles (SMA) sont des maladies rares autosomiques récessives survenant dès l'enfance pour laquelle aucune thérapie n'est efficace à ce jour. Les SMA sont caractérisées par une dégénérescence spécifique des motoneurones entrainant des faiblesses musculaires critiques qui, lorsqu'elles atteignent les muscles respiratoires, provoquent le décès des patients. L'origine de ces maladies est la mutation du gène Survival of Motor Neuron 1 (Smn1) qui induit un déficit en protéine Survival of Motor Neuron (SMN). Tous les patients atteints de SMA possède au moins 2 copies du gène Smn2, qui module la sévérité de la maladie en produisant une faible quantité de protéines SMN complète. En effet, du à l'épissage alternatif de l'exon-7 qui code pour un domaine de stabilité de la protéine SMN, les transcrits produits par l'expression de Smn2 sont dans la plupart des cas incomplets, et génèrent des protéines SMN instables, rapidement dégradées. Ainsi, un objectif thérapeutique majeur dans les SMA est d'augmenter les niveaux de protéines SMN chez les patients. En décryptant les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets bénéfiques de l'exercice physique dans un modèle souris de SMA sévère, le laboratoire a montré que la stimulation directe des récepteurs au NMDA (NMDAR) entraîne une augmentation significative de l'inclusion de l'exon 7 dans les transcrits SMN générés à partir de l'expression du gène Smn2 dans les tissus SMA. Au cours de ma thèse, j'ai participé à l'identification d'un deuxième mécanisme induit par l'exercice, lié à la réduction des niveaux d'expression du récepteur de l'IGF-1 (IGF-1R), qui est surexprimé dans la moelle épinière des souris SMA. La réduction d'IGF-1R suffit à promouvoir l'expression de SMN, à la fois par des effets transcriptionnels et post-transcritionnels. En utilisant une approche transcriptomique visant à identifier les gènes dont l'expression est modifiée de manière comparable par la modulation des NMDAR ou de l'IGF-1R, nous avons identifié un ensemble de gènes qui appartient à la voie de biosynthèse du cholestérol. Des analyses par RT-qPCR et western blot dans la moelle épinière de souris contrôles et modèles de la SMA ont révélées que i) les enzymes de la voie de biosynthèse du cholestérol sont sous-exprimées dans la moelle épinière de souris SMA et dans une culture de fibroblastes issus de patient SMA et ii) le traitement au NMDA ou la réduction d'IGF-1R réactive l'expression des enzymes de la voie de biosynthèse du cholestérol à des niveaux comparables aux témoins. De manière importante, nous avons démontré que l'inhibition spécifique de DHCR24, une enzyme clé de la voie terminale de la biosynthèse du cholestérol, dans les fibroblastes contrôles induit une réduction significative de l'expression de SMN, à la fois au niveau de l'ARNm et de la protéine et qu'à l'inverse, la restauration des niveaux d'expression de DHCR24 dans les fibroblastes SMA humains induit une augmentation significative de l'expression de SMN. De plus, la quantification par GC-MS du cholestérol, de ses métabolites, et de différents oxystérols indique que l'ensemble du métabolisme du cholestérol est altéré dans la moelle épinière de souris SMA, et amélioré par l'activation des NMDAR. L'ensemble de ces résultats mettent en évidence pour la première fois que l'homéostasie du cholestérol est perturbée dans les SMA et que moduler les voies moléculaires dépendantes du cholestérol et de ses dérivés peut constituer une approche thérapeutique prometteuse.
Origine : Version validée par le jury (STAR)