Physical properties of R-Loops and viral capsids : a single molecule approach based on AFM high resolution imaging and nano-indentation
Propriétés physiques de R-loops et de capsides virales : une approche par molécules uniques basée sur la Microscopie à Force Atomique (AFM) par imagerie à haute résolution et nano-indentation
Résumé
By combining high-resolution AFM imaging and nano-mechanical measurements atthe single-molecule level, we studied the physical properties of two different biologicalobjects. R-loops are DNA/RNA hybrid structures arising from the DNA transcription process. The RNA hybridises with its DNA template by Watson-Crick interactions whilethe non-template DNA strand remains single-stranded. The R-loops structures havebeen associated with genomic instability phenotypes in vivo. We characterised byAFM imaging the conformation of these structures generated in vitro. We showed thatthese R-loops, generated for different genes, differ in their architecture by analysingquantitative physical parameters. We concluded that the non-template DNA strandorganisation is a fundamental characteristic to form a compact hybrid object, whichcould then generate replication-dependent DNA breaks. We studied the physical properties of two viral capsids, the AAV vector and the Hepatitis B capsid, connected with their disassembly. By combining the imaging and mechanical response measurement in a liquid medium using AFM, we obtained quantitative information on their mechanical properties. An indentation profile over the capsid shows spatial heterogeneities, which origin is partly geometric and results from an intrinsic heterogeneity linked to the capsid organisation. We also compared the capsid mechanical properties to the ability to release their genome in vitro when induced by temperature. Finally, we studied the Inverted Terminal Repeats (ITRs) structure of AAV. These ITRs adopt a functional structure that we characterised by AFM imaging.
En combinant l’imagerie AFM à haute résolution et les mesures mécaniques à l’échelle nanométrique nous nous sommes intéressés aux propriétés physiques de deux objets biologiques différents. Les R-loops sont des structures hybrides ADN/ARN résultant d’une transcription où l’ARN s’hybride avec sa matrice d’ADN, tandis que le brin d’ADN non matrice reste simple brin. Ces structures R-loops à trois brins ont été associées à des phénotypes d’instabilité génomique in vivo. Nous avons visualisé ces structures générées in vitro caractérisé leur conformation. En s’intéressant à un certain nombre de paramètres physiques quantifiables et en comparant ses données pour plusieurs gènes générant des hybrides, nous avons montré que ces R-loops diffèrent par leur architecture et que l’organisation du brin non modèle est une caractéristique fondamentale pour conduire à la formation d’un objet compact, qui pourrait alors générer des cassures d’ADN dépendantes de la réplication. En combinant l’imagerie de ces capsides en milieu liquide et la mesure de leur réponse mécanique grâce à la nano-indentation AFM, nous avons étudié les propriétés mécaniques des vecteurs AAV (Adeno Associated Virus) et les capsides du virus de l’Hépatite B, en lien avec leur désassemblage. En comparant les données obtenues le long d’un profil spatial enregistré sur différentes capsides, nous avons mis en évidence des hétérogénéités spatiales dont l’origine est pour partie géométrique et résulte également d’une hétérogénéité intrinsèque liée à l’organisation de la capside. Égale- ment, nous avons pu comparer les propriétés mécaniques des capsides et leur capacité à libérer leur génome in vitro par décapsidation induite par la température. Enfin, nous avons étudié la structure des répétitions terminales inversées (ITR) de l’AAV. Ces ITR adoptent une structure fonctionnelle que nous avons caractérisée par l’imagerie AFM.
Origine : Version validée par le jury (STAR)