In vitro and in vivo phenotypic analysis of de novo truncating mutations in SHANK3
Analyses phénotypiques in vitro et in vivo de mutations de novo tronquantes dans le gène SHANK3
Résumé
Autism spectrum disorders (ASD) are neurodevelopmental disorders characterized by deficits in social interactions as well as the presence of repetitive behaviors and restricted interests. It is now well accepted that ASD have a multifactorial origin with a strong genetic basis and a heritability estimated at 50%. SHANK3 is a synaptic gene highly associated with ASD and identified in our laboratory as a major risk for ASD. The SHANK3 protein encodes a scaffolding protein expressed within the synapses of excitatory neurons and plays major role in dendritic spines maturation and formation of synapses.My thesis project focuses on the in vitro and in vivo analysis of de novo heterozygous truncating mutations found in SHANK3 using induced pluripotent stem cells (iPSC) obtained from patients diagnosed with ASD. iPSC model allows to generate a wide number of human neurons that are normally non accessible. Moreover, this model provides the opportunity to study the effect of heterozygous mutations in the patient genetic background and to assess developmental phenotypes of human neurons cultured in vitro or grafted into the neonatal mouse brain. Based on the early onset of cellular impairments in ASD (fetal and perinatal stages) the model used in my project is fully relevant in terms of temporal windows to study synaptic alterations linked to SHANK3 mutations and to follow the development of human neurons at early stages.In order to study the consequences of SHANK3 mutations on the human neuronal development, the laboratory has selected three control individuals and four independent patients carrying heterozygous truncating de novo SHANK3 point mutations. The corresponding iPSC have been generated in collaboration with the I-Stem Institute (Coll Dr A. Benchoua) for their derivation into cortical glutamatergic neurons. The first part of this project conducted in vitro, highlighted reduced densities in dendritic spines and abnormalities in their morphologies in correlation with decreases in SHANK3 mRNA expression. In the second part of the project, neural progenitor cells (NPC) from a control individual have been grafted neonatally (between P0 and P2) into the ventricles or the motor cortex of immunodeficient mice in order to characterize the development of these progenitors in vivo as well as the distribution of their axonal projections in the mouse brain. By co-transplanting NPC from a control individual and from an ASD patient, we observed a diminution in soma size and axonal projections in the ASD patient neurons compare to the control individual neurons. However, there is no significant differences on dendritic spine density and morphology in the early neurodevelopment in vivo between the two populations of neurons grafted together. To conclude, the in vitro approach allows to bring out synaptic alterations in the patient neurons that could be linked to the connectivity anomalies observed in some patients with ASD. The in vivo approach provided complementary data on the cellular connectivity of these neurons in a 3D environment. The iPSC model tested both in vitro and in vivo is then a suitable model that provide wide possibilities to investigate the early cellular mechanisms of ASD.
Les troubles du spectre autistique (TSA) résultent de désordres neurodéveloppementaux caractérisés par une altération des interactions sociales, la présence de comportements répétitifs et d’intérêts restreints. L’origine des TSA est multifactorielle avec une forte composante génétique et leur héritabilité est estimée à 50%. SHANK3 est un gène synaptique majeur pour les TSA, identifié au laboratoire. Il code une protéine d’échafaudage exprimée au niveau de la densité post-synaptique des neurones glutamatergiques excitateurs, et joue un rôle crucial dans la transmission synaptique de ces neurones, la formation des synapses ainsi que dans la maturation des épines dendritiques.Mon projet de thèse porte sur l’analyse in vitro et in vivo de l’effet de mutations de novo hétérozygotes au sein de SHANK3, identifiées chez des individus atteints de TSA sévères. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) obtenues à partir de ces patients, donne accès à un modèle permettant d'étudier l'effet de mutations hétérozygotes dans le contexte génétique du patient. Ce modèle offre la possibilité d’évaluer certains phénotypes à partir de neurones humains en culture ou greffés chez la souris au stade périnatal. Les TSA étant des troubles du neurodéveloppement initiés dès la période fœtale et périnatale, le modèle utilisé dans mon projet se place dans un créneau temporel tout à fait adéquat pour étudier les dysfonctionnements synaptiques liés aux mutations SHANK3, et suivre à des stades précoces, le développement des neurones humains. Ainsi, le laboratoire a sélectionné 3 individus contrôles ainsi que 4 patients indépendants portant dans leur génome, des mutations de novo hétérozygotes tronquantes dans SHANK3. Les iPSC correspondantes ont été générées en collaboration avec le laboratoire I-Stem (Coll A. Benchoua), avant d’être dérivées cellules progénitrices neurales (NPC), puis différenciées en neurones corticaux glutamatergiques pyramidaux. La partie in vitro de ce projet a permis de mettre en évidence une diminution significative du niveau d’ARNm de SHANK3 dans les cellules des patients, corrélée à une réduction de 50 % de la densité des épines dendritiques avec la mise en évidence de diverses modifications de leur morphologie en 3D. Pour le projet de greffe de NPC in vivo, les progéniteurs neuraux d’un individu contrôle représentatif ont été transplantées seules dans les ventricules ou dans le cortex moteur de souris immunodéficientes à leur naissance afin de caractériser le développement de ces progéniteurs in vivo et la distribution de leurs projections axonales dans le cerveau murin adulte. La co-transplantation des NPC de l’individu contrôle et de celles d’un patient a ensuite montré une diminution de la taille des somas des neurones issus du patient, ainsi que de leurs projections axonales par rapport aux neurones de l’individu contrôle. Les épines dendritiques ne présentent pas de différences significatives aux stades précoces de développement in vivo.En conclusion, l’approche in vitro a permis de mettre en évidence des altérations synaptiques chez les neurones des patients pouvant être reliés aux anomalies de la connectivité observée chez divers patients avec TSA. L’approche in vivo a fourni des données complémentaires concernant la connectivité cellulaire de ces neurones en mettant en évidence une baisse des projections axonales développées dans le cerveau murin. Le modèle iPSC humaines testé à la fois in vitro et in vivo chez la souris offre ainsi un large champ d’investigation pour décrypter les mécanismes précoces à l'origine des TSA.
Domaines
Neurobiologie
Origine : Version validée par le jury (STAR)