Induction de la mort ferroptotique dans les cellules de cancer pancréatique : rôle essentiel de la cystéine et du transporteur xCT

Boutaina Daher

Résumé

When compared with normal, non-transformed counterparts, cancer cells exhibit a modified proliferation profile, supported by intensified metabolic activity. Consequently, this leads to greater requirements of the cancer cells for nutrients, but also for antioxidant defence that can counteract increased production of reactive oxygen species (ROS) as a necessary by-product of the metabolism. Cysteine is an amino acid with a dual function within the cell. Indeed, in addition to its proteogenic role like all the other 21 amino acids, cysteine plays an important role in the antioxidant functions of the cell. Namely, cysteine is a rate-limiting amino acid for synthesis of the major redox molecule of the cell: the glutathione (GSH). GSH serves as a reducing equivalent for many antioxidant enzymes, including large family of peroxidases (glutathione peroxidases, GPx), such as GPx4 that ensures the reduction of lipid peroxides in the membrane compartment of the cell. The maintenance of an intracellular cysteine level is done by a set of incompletely characterized transporters, among which the best known is xCT – the transporter of the oxidized form of cysteine (cystine). This transporter is part of a “minimal set” of transporters overexpressed in the majority of cancers, together with LAT1 and ASCT1/2. A disbalance in the intracellular cysteine and glutathione homeostasis leads to disturbed cellular redox status, an accumulation of lipid peroxides, and finall to a recently described non-apoptotic type of cell death named ferroptosis. In this thesis, we initially investigated the impact of a genetic invalidation (CRISPR-Cas9) of the xCT transporter on different pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell lines. The resulting xCT-KO cells exhibit nutrient stress with an activation of the GCN2/ATF4 pathway and an inhibition of general protein synthesis via mTORC1 suppresion. In addition, these cells undergo ferroptosis unless alternative source of cysteine (N-acetylcysteine, NAC) is added. Indeed, the depletion of glutathione in these cells induces a notable accumulation of lipid peroxides, thus compromising the membrane integrity of cells. Therefore, according to the data, the xCT/cysteine/GSH/GPx4 axis seems crucial for ferroptotic cell death in PDAC cells. Subsequently, in the second part of this thesis, we look at the role played by glutathione in the occurrence of ferroptosis, independently of intracellular cysteine. For this we invalidated the catalytic subunit of the gene responsible for its biosynthesis, γ-Glutamate Cysteine Ligase (GCLC). These GCLC-KO cells also undergo cell death; however, interestingly, our results showed that the cells lacking glutathione but not cysteine die in a ferroptosis-independent manner (it could not be prevented by classical ferroptosis inhibitors) and are partially saved by apoptosis inhibitors. In conclusion, the studies carried out during this thesis demonstrated that: 1) the xCT/cysteine/GSH/GPx4 axis plays a crutial role in ferroptosis of PDAC cells, and 2) the suppression of GSH biosynthesis, without affecting the cysteine intracellular pool, results in progressive cell death by apoptosis. These results thus highlight the complexity of cysteine role in the occurrence of cell death by ferroptosis independently of glutathione biosynthesis/availability.

Les cellules cancéreuses possèdent un profil de prolifération et un métabolisme très accru nécessitant de sérieuses adaptations. Les tumeurs ont par conséquent, un besoin d’import de nutriments élevé mais aussi des défenses antioxydantes solides afin de combattre la toxicité des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les acides aminés, éléments clé de la structure et fonctionnalité des protéines, sont l’un des trois macronutriments essentiels pour la croissance tumorale. La cystéine est un acide aminé présentant une double fonction au sein de la cellule car en plus de son rôle protéogénique, la cystéine joue un rôle majeur dans les fonctions antioxydantes. C’est en effet le facteur limitant dans la biosynthèse de l’acteur clé du maintient du potentiel redox intracellulaire : le glutathion. Le potentiel redox de ce tripeptide (glutamate, cystéine et glycine) est notamment utilisé par de multiples enzymes dont les peroxydases afin de détoxifier les produits des ROS et parmi une large famille de peroxydases, la glutathion peroxydase 4 (GPx4) assure la réduction des lipides peroxydés. Le maintien d’un niveau de cystéine intracellulaire se fait par un ensemble de transporteurs incomplètement caractérisés dont le principal est le transporteur de la forme oxydée cystine: xCT (échangeur glutamate/cystine 1 :1). Ce transporteur fait parti d’un ‘trio’ minimal de transporteurs surexprimés dans la majorité des cancers (LAT1, ASCT2/1 et xCT). Une perturbation de l’homéostasie intracellulaire de cystéine et de glutathion entraine un stress oxydatif provoquant une accumulation des lipides peroxydés et conduit à une mort non-apoptotique récemment décrite : ‘ferroptose’ rappelant le rôle clé de la biologie du fer dans ce mécanisme. Dans la présente thèse, nous nous sommes initialement intéressé à l’étude de l’impact de l’invalidation génétique (CRISPR-Cas9) du transporteur xCT sur différentes lignées d’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). Les cellules xCT-KO obtenues présentent un stress nutritif avec une activation de la voie de stress nutritionnelle GCN2/ATF4 ainsi qu’une inhibition de la synthèse protéique générale par une inhibition de mTORC1. De plus, ces cellules entrent en ferroptose lors de l’absence d’apport en source de cystéine notamment par l’ajout de N-Acétylcystéine (NAC) dans le milieu. En effet, la déplétion en glutathion dans ces cellules induit une accumulation notable de lipides peroxydés altérant ainsi l’intégrité membranaire des cellules. Par conséquent, l’axe xCT/Cystéine/Glutathion/GPx4 joue ainsi un rôle crucial dans la mort par ferroptose. Par la suite, dans la deuxième partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés au rôle joué par le glutathion dans la survenu de la ferroptose, indépendamment de la cystéine. Pour cela nous avons invalidé la sous unité catalytique du gène responsable de sa biosynthèse, la γ-Glutamate Cystéine Ligase (GCLC). De manière intéressante, nos résultats démontrent que la mort cellulaire qui survient dans les cellules dépourvues en glutathion, mais ayant gardé un pool intracellulaire en cystéine inchangé, ne présentent pas le même profil de mort cellulaire que les cellules xCT-KO entrant en ferroptose et non pas en apoptose. En conclusion, les études menées durant cette thèse démontrent: 1) que l’axe xCT/Cysteine/Glutathion/GPx4 joue un rôle crucial dans la mort par ferroptose 2) que la suppression de la biosynthèse du glutathion sans impact sur l’homéostasie de la cystéine déclenche une mort cellulaire progressive par apoptose. Ces résultats mettent ainsi en évidence le rôle de la cystéine comme co-substrat pour la GPx4 en l’absence de glutathion.

Induction of ferroptotic death in pancreatic cancer cells : essential role of cysteine and the xCT transporter