Investigation of fluorescence fluctuation microscopy methods to measure molecular density on substrates and characterize processes in optogenetics
Développements de méthodes de microscopie de fluctuations de fluorescence : application aux mesures de densité de protéines sur substrats et à la caractérisation de processus d'optogénétique
Résumé
Quantitative analysis in microscopy imaging has always been a challenge. One noticeable quantitative technique is Fluorescence Fluctuation Microscopy, which is a family of analytical tools generally developed for confocal microscopes that takes advantage of the temporal and/or spatial fluctuations of the fluorescence signal emitted by molecules, Firstly, we developed an approach that combines Image Correlation Spectroscopy with photobleaching to better estimate the surface density of immobilized molecules. The model is useful to overcome the limitation of the standard Image Correlation Spectroscopy when applied to systems of molecules with multi-labeling or aggregates. It has been successfully tested on fluorescence beads that exhibit a wide distribution of brightness. The model was then applied to proteins of the extracellular matrix deposited on the substrate and oligomerization of protein in the cell cytoplasm. Secondly, we performed Raster Image Correlation Spectroscopy on CRY2/CIBN optogenetics cells and studied the dynamics of the proteins of the cytoplasmic CRY2 and membranous CIBN proteins. The technique covers a wide range of diffusional processes; thus, it is useful to measure the diffusion constant for both proteins, including a mapping of protein mobility in membrane revealing a different dynamics over the whole area. We also managed to characterize the dissociation process of CRY2/CIBN.
L'analyse quantitative en imagerie microscopique est toujours un défi. Une technique quantitative notable est la Microscopie de Fluctuation de Fluorescence, qui est une famille d'outils analytiques généralement développés pour les microscopes confocaux, qui tire parti des fluctuations temporelles et/ou spatiales du signal de fluorescence émis par les molécules. Premièrement, nous avons développé une approche qui combine l'Image Correlation Spectroscopy avec photoblanchiment pour mieux estimer la densité des molécules immobilisées au surface. Le modèle est utile pour surmonter la limitation de l'Image Correlation Spectroscopy standard lorsqu'elle est appliquée à des systèmes de molécules de multi-marqueurs ou des agrégats. Il a été testé avec succès sur des billes de fluorescence qui qui montrent une large distribution d’intensité lumineuse. Le modèle est également démontré sur des protéines de la matrice extracellulaire déposées sur le substrat et oligomérisation des protéines dans le cytoplasme. Deuxièmement, nous avons réalisé des outils de la Raster Image Correlation Spectroscopy sur des cellules optogénétiques de CRY2/CIBN et étudié la dynamique des protéines cytoplasmique de CRY2 et des protéines membranaires de CIBN. La technique couvre un large processus de diffusion ; ile est donc utile de mesurer la constante de diffusion pour les deux protéines et fournit une carte de mobilité des protéines dans la membrane révélant une dynamique différente sur toute la zone. Nous avons également réussi à caractériser le processus de dissociation de CRY2 / CIBN.
Origine : Version validée par le jury (STAR)