Analyzing the role of SoxC genes in murine kidney development
Étude du rôle des gènes SoxC au cours du développement du rein de souris
Résumé
Congenital Anomalies of Kidneys and Urinary Tract (CAKUT) are a group of birth defects that arise from defects in the developmental program of organ development and are frequently found in human patients. Sox11 is a member of SoxC family of transcription factors, which plays an important role in the development of various organs in vertebrates. Sox11 knockout mice die soon after birth and display a wide variety of CAKUT, including duplex kidneys and nephrogenesis defects. While duplex kidneys are a common renal development anomaly, the molecular mechanism causing Sox11 mutants to develop duplex kidneys remains unclear. In this project, I analyzed the renal phenotype of Sox11 knockout mice and discovered that the duplex kidneys are caused by the expansion of metanephric mesenchyme (MM). Further experiments were performed to determine whether the origin of this expansion lies in insufficient apoptosis of MM cells or lack of MM cell migration. Three-dimensional confocal microscopy analysis with Lysotracker Red staining of apoptotic cells revealed that MM undergoes apoptosis in the region of interest in wildtype embryos, however the apoptosis seems to persist in Sox11-/- embryos as well. However, in vitro scratch wound assay provided evidence that SoxC genes are necessary for migration of MM cells. In the late kidney development, SoxC deletion is leading to renal hypoplasia and reduced nephron number due to cessation of nephrogenesis. To study the role of SoxC in nephrogenesis, I set up an in vitro renal progenitor cell culture which allows for the timed deletion of SoxC genes by a 4OH-tamoxifen induced knockout. Gene expression analysis confirmed efficient deletion of SoxC genes, while maintaining nephron progenitor cell identity. After deletion, renal progenitor cells were found to be unable to epithelialize, linked with increased activity of Wnt/β-catenin pathway. To validate these findings and discover the downstream targets of SoxC genes, I developed a system for an RNA-seq analysis of renal organoids undergoing mesenchymal-to-epithelial transition. Data acquired in these experiments reveal numerous regulatory pathways affected in SoxC-knockout renal progenitor cells, with the deficiency of Polycomb group gene Ezh2 as a likely origin of widespread transcription changes leading to the inability of SoxC-deficient progenitor cells to differentiate. Taken together these data demonstrate the importance of Sox11 and other SoxC genes in early and late kidney development, with molecular analysis providing plausible directions for future research and interventions.
Les anomalies congénitales des reins et des voies urinaires (CAKUT) sont un groupe de malformations fréquemment trouvées chez les patients humains qui résultent de défauts dans le programme de développement de ces organes. Sox11 fait partie de la famille des facteurs de transcription SoxC, qui joue un rôle important dans le développement de divers organes chez les vertébrés. Les souris Sox11-/- meurent juste après la naissance et présentent une grande variété de CAKUT. Alors que les reins duplex sont une anomalie courante du développement rénal, le mécanisme moléculaire qui amène les mutants Sox11 à développer cette malformation reste incertain. Dans ce projet, j'ai analysé le phénotype rénal des souris Sox11-/- et montré que les reins duplex sont causés par l'expansion du mésenchyme métanéphrique (MM). D'autres expériences ont été réalisées pour déterminer si l'origine de cette expansion résidait dans une apoptose insuffisante ou dans l'absence de migration des cellules du MM. Une analyse tridimensionnelle par microscopie confocale des cellules apoptotiques a révélé que chez les embryons Sox11-/- le MM subissait une apoptose dans la région d'intérêt similaire à celles des embryons de type sauvage. Un test in vitro de cicatrisation des plaies a démontré que les gènes SoxC sont nécessaires pour la migration des cellules du MM. La délétion de ces gènes à un stade tardif du développement conduit à une hypoplasie rénale et à une diminution du nombre de néphrons due à l'arrêt de la néphrogenèse. Pour étudier le rôle des gènes SoxC au cours de la formation des reins, j'ai établi une culture de cellules progénitrices rénales permettant l’invalidation de ces gènes en présence de 4OH-Tamoxifène. L'analyse de l'expression génique a confirmé la suppression efficace des gènes SoxC, tout en maintenant l'identité des cellules progénitrices du néphron. Après induction de la délétion, ces cellules sont incapables de s'épithélialiser, du fait d’une activité accrue de la voie Wnt/β-caténine. Afin de valider ces résultats et d’identifier les cibles en aval des gènes SoxC, j'ai effectué une analyse ARN-seq d’organoïdes rénaux subissant une transition mésenchymateuse-épithéliale. Les données acquises par ces expériences révèlent que de nombreuses voies de signalisation sont affectées. En particulier, l’insuffisance du gène Ezh2 codant pour une protéine du groupe Polycomb, pourrait être à l’origine de changements transcriptomiques généralisés empêchant les cellules progénitrices déficientes en SoxC de se différencier. L’ensemble de ces données démontre l'importance des gènes de la famille SoxC dans le développement précoce et tardif du rein, dont l'analyse moléculaire conduira à des orientations possibles pour les recherches et les traitements futurs.
Origine : Version validée par le jury (STAR)