OPTO-MECHA-SPIM : Dynamic and interactive imaging of mechanobiological phenomena in tissues
OPTO-MECA-SPIM : imagerie dynamique et interactive de phénomènes mécanobiologiques dans les tissus
Résumé
In recent years, tissue mimics (TMs) such as microtissues, spheroids, and organoid cultures have become increasingly important in life-science research, as they provide a physiologically relevant environment for cell growth, tissue morphogenesis, and stem cell differentiation. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) is one of the most prominent microscopy modalities for three-dimensional tissue imaging, and a sine qua non tool to understand cell biology in TMs. However, while SPIM is regarded as a very powerful tool for TM imaging, optical microscopy suffers from certain limitations when imaging 3D samples. Indeed, scattering, absorption and optical aberrations limit the depth at which useful imaging can be done, typically no more than 100 µm. Adaptive Optics (AO) is a technique capable of improving image quality at depth by correcting the optical aberrations introduced by the sample which is seeing increasing use in fluorescence microscopes. For this thesis, I have incorporated a wavefront sensor AO scheme to SPIM, able to correct aberrations in optically thick TMs such as multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Due to the low amount of light produced by non-linear guide stars such as the one used in our system, a custom high-sensitivity Shack-Hartmann wavefront sensor (SHWFS) was developed for our needs. In this work, I characterize the performance of this SHWFS and the ability of our system to correct aberration in various conditions, including inside TMs. I show unprecedented image quality improvements for in-depth imaging of MCTS, in regard of high-frequency detail and resolution. This allowed us to identify biologically relevant features at depths inaccessible to conventional SPIM. Up-converting nanoparticles (UCNP) are rare-earth based particles that are able to undergo photon up-conversion when illuminated, emitting light of a shorter wavelength than that of the illumination. Guide stars made from UCNP are especially attractive due to the possibility of them being excited in the near-infrared while emitting visible light, reducing photodamage produced by the illumination light. The viability of using UCNP as guide stars in biological samples in explored in this thesis.
Les modèles en 3D occupent une place de plus en plus importante en biologie cellulaire car ils offrent de nombreux avantages pour la compréhension des processus physiopathologiques. La microscopie à feuille de lumière et plus particulièrement, le Selective Plane Illumination Microscope (SPIM), un de ses variants, représente un outil de choix pour observer et imager avec une haute résolution spatio-temporelle ces structures assimilées à des tissus (TM). Bien que le SPIM est un outil puissant, il souffre de phénomènes tels que la diffusion, l'absorption et les aberrations optiques qui limitent la profondeur à laquelle une imagerie utile peut être réalisée. L'optique adaptative (AO), de plus en plus utilisée dans le domaine de la microscopie, est une technique capable d'améliorer la qualité d'imagerie en profondeur en corrigeant les aberrations optiques introduites par l'échantillon. Pour ce travail de thèse, j'ai implémenté dans un SPIM un système d'AO capable de corriger les aberrations dans les TMs optiquement épais tels que les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS). Un capteur de front d'onde de type Shack-Hartmann (SHWFS) à haute sensibilité a été développé à façon afin de permettre la reconstruction du front d'onde à partir de la faible quantité de lumière produite par l'étoile guide non linéaire utilisé dans notre système. Au cours de ce travail, j'ai tout d'abord caractérisé les performances de ce SHWFS et évalué la capacité du système à corriger les aberrations dans diverses conditions, y compris à l'intérieur de TMs. J'ai observé des améliorations sans précédent de la qualité d'image en profondeur des MCTS, en termes de détails et de résolution haute-fréquence. Grâce à ces corrections, j'ai pu mettre en évidence des évènements biologiques tels que des mitoses non visibles sans corrections. Les " up converting " nanoparticules (UCNP) sont des particules de terres rares capables d'émettre une lumière d'une longueur d'onde plus courte que celle de l'éclairage lorsqu'elles sont illuminées. Les étoiles guides en UCNP sont particulièrement intéressantes en raison de la possibilité qu'elles soient excitées dans l'infrarouge proche tout en émettant de la lumière visible, ce qui réduit le photodommage produit par l'éclairage. La possibilité d'utiliser des UCNP comme étoiles guides dans des échantillons biologiques a été explorée dans cette thèse.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
Loading...