Endothelial nitric synthase dysfunction during preeclampsia : role of glutathione and oxidative stress
Dysfonction de la nitric oxide synthase endothéliale au cours de la pré-éclampsie : rôle du glutathion et du stress oxydant
Résumé
Context: During pre-eclampsia (PE), the defective trophoblastic invasion and remodeling of the uterine spiral arteries leads to poor adaptation of utero-placental circulation associated with hypoxia/reoxygenation phenomena. This induces oxidative stress and an imbalance between angiogenic/antiangiogenic factors (decrease in VEGF and PIGF vs. increase in sFlt1) responsible for abnormal placentation, endothelial dysfunction and systemic inflammation. Endothelial nitric oxide synthase dysfunction (eNOS) and decreased NO bioavailability play a critical role in the pathophysiology of PE. eNOS is the main source of placental NO production, and plays a key role in homeostasis and vascular tone regulation. Recent evidence indicates that eNOS may undergo glutathionylation in the vascular wall, and subsequent uncoupling in a prooxidant environment, this resulting in an increased generation of superoxide anion and a decreased production of NO. Objective: The purpose of this work was to study the consequences of oxidative stress on placental eNOS, in particular its glutathionylation and modification by lipid oxidation products (LPO), in relation to its dysfunction observed during PE. Materials and Methods: The modification of eNOS was studied in placental tissues obtained from preeclampsia-affected (n=13), vs normal pregnant women (n=9) and in HTR-8/SVneo human trophoblasts exposed to hypoxia/reoxygenation (H/R), or by exposure to LPO. Results: Immunofluorescence and confocal microscopy revealed a high glutathionylation of eNOS in PE placentas, reversed by dithiotreitol, which was confirmed by immunoprecipitation and western-blot experiments, with no difference in total eNOS expression between PE and normal pregnancy. Exposure of HTR8 trophoblasts to H/R conditions generates S-glutathionylation of eNOS associated with reduced NO production, and increased superoxide anion generation. NO is necessary for the invasive potential of trophoblasts, since trophoblasts exposed to H/R, or silenced for eNOS by small interfering RNAs (siRNA), showed a decreased migration capacity, which was restored by the NO donor, NOC-18. In the second part of this work, we investigated the presence of LPO in PE placentas, and hypothesized that eNOS could be a target of these agents. We show that LPO such as 4-hydroxynenal (4-HNE), and 4-oxo-2-nonenal (ONE), accumulate in PE placentas, particularly on eNOS, while no changes are observed in normal pregnancy placentas. Proteomics studies on recombinant eNOS show that ONE and 4-HNE modify several epitopes (ONE-Lys, HNE-His, HNE-Cys). The addition of 4-HNE or ONE to HTR8 inhibits NO production and cell migration, restored by the addition of NOC-18. Conclusions and perspectives: These results show that placental eNOS is an important target for oxidative stress during PE, with modifications by S-glutathionylation or adduct formation with ONE or 4-HNE, associated with a decrease in NO production. These changes could contribute to the dysfunction of placental eNOS observed during the PE. In perspective, we plan to study the consequences of oxidative stress and LPO on accelerated placental aging, which may contribute to the pathophysiology of PE, and beyond, of pathological pregnancies.
Contexte. Au cours de la pré-éclampsie (PE), le défaut d'invasion trophoblastique et de remodelage des artères utérines spiralées génère une mauvaise adaptation de la circulation utéro-placentaire associée à des phénomènes d'hypoxie/réoxygénation (H/R). Il en résulte un stress oxydant et un déséquilibre des facteurs angiogéniques/antiangiogéniques (diminution du VEGF et PIGF vs augmentation du sFlt1) responsables d'une placentation anormale, une dysfonction endothéliale et une inflammation systémique. Le dysfonctionnement de l'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) et la diminution de la biodisponibilité du NO, jouent un rôle critique dans la pathophysiologie de la PE. eNOS est la principale source de production du NO dans le placenta, et elle joue un rôle primordial dans l'homéostasie et la régulation du tonus vasculaire. Des données récentes indiquent que eNOS peut être modifiée au cours du stress oxydant, en particulier par S-glutathionylation, ce qui entraine son découplage avec une génération d'ion superoxyde et une réduction du NO. Objectif. Le but de ce travail a été d'étudier les conséquences du stress oxydant sur la eNOS placentaire, en particulier sa glutathionylation, et les modifications par les produits d'oxydation lipidique (LPO), en relation avec sa dysfonction observée au cours de la PE. Matériels et Méthodes. La modification de eNOS a été étudiée dans des tissus placentaires obtenus à partir de césariennes réalisées chez des patientes pré-éclamptiques (n=13), vs grossesses normales (n=9). Des études complémentaires sont réalisées sur des trophoblastes humains HTR-8/SVneo exposés à un stress oxydant induit par H/R, ou par exposition à des LPO. Résultats : Les études en immunofluorescence et microscopie confocale montrent une importante glutathionylation de eNOS dans les placentas de PE, sensible aux agents réducteurs (dithiotréitol), sans différence d'expression de eNOS totale entre PE et grossesses normales. La S-glutathionylation est confirmée par immunoprécipitation et Western Blot de la eNOS placentaire. L'exposition des trophoblastes HTR8 à des conditions d'H/R, génère une S-glutathionylation d'eNOS associée à une production réduite de NO, et une génération d'ion superoxyde. Le NO est nécessaire pour le potentiel invasif des trophoblastes, comme démontré par l'absence de migration des HTR8 après inhibition spécifique de eNOS par small ARN interference (siRNA), et rétablie après addition d'un donneur de NO, le NOC-18. Les trophoblastes exposés aux variations H/R, montrent des capacités de migration diminuées témoignant d'un potentiel invasif réduit, et rétabli par NOC-18. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons recherché la présence de LPO dans les placentas de PE, et nous avons émis l'hypothèse que eNOS puisse être une cible de ces agents. Nous montrons que les LPO tels que le 4-hydroxynonenal (4-HNE), et le 4-oxo-2-nonenal (ONE), s'accumulent dans les placentas de PE, en particulier sur la eNOS, alors qu'aucune modification n'est observée dans les placentas de grossesse normale. Les études en protéomique sur eNOS recombinante, montrent que ONE et 4-HNE modifient plusieurs épitopes (ONE-Lys, HNE-His, HNE-Cys). L'addition de 4-HNE ou de ONE aux HTR8, inhibe la production de NO et la migration des cellules, restaurée par l'addition de NOC-18. Conclusions et perspectives : Ces résultats montrent que la eNOS placentaire est une cible importante du stress oxydant au cours de la PE, avec des modifications par S-glutathionylation ou par formation d'adduits avec ONE ou 4-HNE, associées à une diminution de la production de NO. Ces modifications pourraient contribuer au dysfonctionnement de la eNOS placentaire observé au cours de la PE. En perspective, nous pourrons étudier les conséquences du stress oxydant et des LPO, sur le vieillissement accéléré du placenta, qui contribueraient à la physiopathologie de la PE.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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