Dehydrogenases and laccases on the redox surfaces : toward applications in bioelectronic
Déshydrogénases et laccases sur des surfaces redox : vers des applications en bioélectronique
Résumé
In order to design a bioanode working with NAD+-dependent-dehydrogenases, we have studied a molecular assembly on carbon electrodes allowing for the immobilization of nicotinic cofactors. An electopolymer of toluidin blue O (TBO) formed at the surface of vitreous carbon electrodes was used as an electrocatalyst to induce NADH oxidation by Mediated Electron Transfer (MET). In an effort to immobilize the nicotinic cofactor on the TBO electropolymer, the 3-aminophenylboronic acid (3AB) was used as a linker molecule. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) and electrochemistry measures were carried out on gold electrodes modified by electrografted 3AB previously diazoted. These electrodes are able to immobilize the NAD+ with a molecular density of 0.3 ± 0.03 pmol.mm-2. The linear voltammetry measures have shown that in presence of formate dehydrogenase (FDH) and formate, these electrodes provide a power density of 14 μW.cm-2 at +690 mV (vs.Ag/AgCl). Next, an electrochemistry method enabling the measurement of oxidoreductase activities was developed. This method works with a device able to perform simultaneously intermittent pulse amperometry (IPA) on 96 screen-printed carbon electrodes. This device was used for the NADH oxidation by MET using electrografted redox phenazine mediators. The electrografted TBO had a NADH sensibility of 3586 ± 164 nA.mM-1. This construct was used to screen a library of FDH mutants. A p-value lower than 0.001 (p-value < 0,001, n = 77) showed a high correlation between the results obtained via electrochemical screening and colorimetric screening using PES/NBT couple (Phénazine Ethosulfate/Nitrobleu de tétrazolium). This method was also used to measure the Direct Electron Transfer (DET) with the laccase from Trametes versicolor (TvLac) adsorbed onto 96 carbon electrodes with a coefficient of variation of 22%. This DET can be measured at +100 mV (vs. Ag/AgCl) and at pH 5.4 with a linear range of adsorbed TvLac between 0.5 ng and 75 ng (corresponding to an enzymatic activity of 62 X 10-6 U et 9.37 X 10-3 U) and a sensibility of 3027 μg-1. In addition, this electrochemical device was used to evaluate the inhibitor effect of the DET of fluoride (F-) and azide (N3 -) yielding IC50 values of 280 ± 14 μM et 1.2 ± 0.4 μM. The validation of this study has subsequently allowed to initiate the establishment of a protocol screening for the directed evolution of CotA laccase from Bacillus subtilis
Afin de concevoir une bioanode fonctionnant avec les déshydrogénases à NAD+, un assemblage moléculaire permettant l'immobilisation des cofacteurs nicotiniques sur une électrode de carbone a été étudié. Un électropolymère de bleu de toluidine O (TBO) généré à la surface d'une électrode de carbone vitreux a été choisi comme électrocatalyseur pour réaliser l'oxydation du NADH par transfert indirect d'électron (MET). Afin d'immobiliser le cofacteur nicotinique sur l'électropolymère de TBO, l'acide 3-aminophénylboronique (3AB) a été utilisé comme molécule « linker ». Des mesures par imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi) et électrochimiques ont été réalisées sur des électrodes d'or modifiées par l'électro-greffage de 3AB préalablement diazotés. Ces électrodes sont capables d'immobiliser le NAD+ avec une densité moléculaire de 0,3 ± 0,03 pmol.mm-2. Des mesures de voltammétrie linéaire ont montré qu'en présence de formiate déshydrogénase et de formiate, ces électrodes fournissent une densité de puissance de 14 μW.cm-2 à +690 mV (vs.Ag/AgCl). Une méthode de criblage électrochimique permettant de mesurer des activités oxydoreductases à par la suite été développée. Cette méthode utilise un système capable d'effectuer simultanement des mesures ampérométriques pulsées par intermittence (IPA) sur 96 électrodes de carbone sérigraphiées sur une plaque de circuit imprimé. Il a été utilisé pour cribler par MET l'oxydation du NADH à l'aide de médiateurs redox de type phénazine électro greffés. La sensibilité au NADH est de 3586 ± 164 nA.mM-1 pour le TBO électro-greffé. Ce dernier a été utilisé pour cribler une banque de mutants de la formiate déshydrogénase. Une valeur de p inférieure à 0,001 (p-value < 0,001, n = 77) a permis de montrer une forte corrélation entre le crible électrochimique et le crible colorimétrique réalisé en présence du couple PES/NBT (Phénazine Ethosulfate/Nitrobleu de tétrazolium ). Cette méthode a également permis de mesurer le transfert direct d'électrons (DET) avec la laccase de Trametes versicolor (TvLac) adsorbée sur les 96 électrodes de carbone avec un coefficient de variation de 22%. Ce DET peut être mesuré à +100 mV (vs.Ag/AgCl) à un pH de 5,4 avec une gamme linéaire de TvLac adsorbé comprise entre 0,5 et 75 ng (correspondant à une activité enzymatique de 62. 10-6 et 9,37 10-3 U) et une sensibilité de 3027 μg-1. Cette méthode a également été utilisée pour évaluer l'effet inhibiteur du fluorure (F-) et à l'azoture (N3 -) sur ce DET avec des valeurs d'IC50 de 280 ± 14 μM et 1,2 ± 0,4 μM. La validation de cette étude à permis par la suite d'initier la mise en place d'un protocole de criblage pour l'évolution dirigée de la laccase CotA de Bacillus subtilis
Origine : Version validée par le jury (STAR)