The development of new qualitative and quantitative metal speciation approaches for low molecular weight metals complexes in plants
Développement de nouvelles approches qualitatives et quantitatives de spéciation des métaux impliqués dans les complexes de faibles poids moléculaires circulant dans les plantes
Résumé
The main goal of this thesis was to develop and validate protocols of mass spectrometry methods, which could be applied for determination and quantitation of low molecular weight metal compounds in plant liquids. Unfortunately, the amount of plant liquid (eg. xylem), which usually can be sampled after several weeks of fastidious plant cultivation, is in low microliters range (or lower), which make the method development difficult task. Thus, as a compromise, coconut (Cocos nucifera) water was chosen as a model for method development studies of plant endosperm metallome, as the amount of sample available for experiments is much higher. Based on the information available in literature the most commonly identified iron complexes were Fe-citrate ones and mixed complexes of iron with citrate and malate. The detailed study of formation of different complexes was carried out to evaluate their stability and equilibrium between them. Additionally different chromatographic columns were tested and elution condition were optimized to be used later on to the real samples. ESI MS condition were adjusted (positive or negative mode ionization) depending on chromatographic conditions used. The principal part of the thesis concerns the development of methods for characterization of the model sample. Influence of different sample treatment steps (filtration, centrifugation) and storage condition was studied. Also, sample preparation before HILIC separation was evaluated, and the separation conditions optimized on model complexes was tested. The quest of a generic analytical strategy for the standardless quantification of different low-molecular weight metal complexes by molecular mass spectrometry is pursued using the Isotope Dilution Analysis (IDA) with the addition of an isotope spike 58Fe in ionic form and HILIC-ICP-MS. The protocol was carefully studied in order to keep the original metal complexes in non-degraded way and achieve the formation of metal complexes with the excess of ligands present in the sample. Finally, the developed procedures were applied for characterisation and quantification of iron compounds in xylem samples of several plants. The plants chosen (Pisum sativum, Paspalum urvilleli, and Setaria parviflora) were hypertolerant or overaccumulating ones.
L'objectif principal de cette thèse était de développer et de valider des protocoles de méthodes de spectrométrie de masse, qui pourraient être appliqués à la détermination et à la quantification de composés métalliques de faible poids moléculaire dans des liquides végétaux. Malheureusement, la quantité de liquide végétal (par exemple, le xylème), qui peut généralement être échantillonnée après plusieurs semaines de culture fastidieuse, se situe dans la plage des microlitres (ou inférieure), ce qui rend difficile le développement de la méthode. Ainsi, comme compromis, l’eau de coco (Cocos nucifera) a été choisie comme modèle pour les études de développement de méthodes d’endospermes de plantes, car la quantité d’échantillon disponible pour les expériences est beaucoup plus importante. Sur la base des informations disponibles dans la littérature, les complexes de fer les plus communément identifiés étaient ceux de citrate de Fe et de complexes mixtes de fer avec citrate et malate. L'étude détaillée de la formation de différents complexes a été réalisée pour évaluer leur stabilité et leur équilibre. En outre, différentes colonnes chromatographiques ont été testées et les conditions d'élution ont été optimisées pour une utilisation ultérieure sur les échantillons réels. Les conditions MS ESI ont été ajustées (ionisation en mode positif ou négatif) en fonction des conditions chromatographiques utilisées. La partie principale de la thèse concerne le développement de méthodes de caractérisation de l’échantillon du modèle. L'influence de différentes étapes de traitement des échantillons (filtration, centrifugation) et des conditions de stockage a été étudiée. La préparation des échantillons avant la séparation HILIC a également été évaluée et les conditions de séparation optimisées sur les complexes modèles ont été testées. La recherche d'une stratégie analytique générique pour la quantification sans standard de différents complexes métalliques de faible poids moléculaire par spectrométrie de masse moléculaire est poursuivie à l'aide de l'analyse de dilution isotopique (IDA) avec l'ajout d'un pic isotopique 58Fe sous forme ionique et HILIC-ICP-MS. Le protocole a été soigneusement étudié afin de conserver les complexes métalliques d'origine de manière non dégradée et d'obtenir la formation de complexes métalliques avec l'excès de ligands présents dans l'échantillon. Enfin, les procédures développées ont été appliquées à la caractérisation et à la quantification des composés du fer dans des échantillons de xylème de plusieurs plantes. Les plantes choisies (Pisum sativum, Paspalum urvilleli et Setaria parviflora) étaient hypertolérantes ou hyperaccumulatrices.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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