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Theses

Structural and functional insights into the substrate specificity of OXA-48-like carbapenemases

Résumé : Les b-lactamines, grâce à leur efficacité clinique, sont parmi les antibiotiques les plus prescrits pour traiter des infections bactériennes. Cependant, leur utilité est compromise par la prolifération des b-lactamases (BLs) avec des profils d’hydrolyse de substrats très larges. La résistance induite par les BLs compromet également les b-lactamines les plus puissantes (c-à-d les carbapénèmes). OXA-48, une carbapénèmase de classe D (CHDL), a été initialement identifiée dans une souche de K. pneumoniae de Turquie en 2001. OXA-48 hydrolysent fortement les pénicillines, faiblement les carbapénèmes, et quasiment pas les céphalosporines de troisième génération (C3G). Cependant certains variants comme OXA-163 ou OXA-405 hydrolysent les C3G et pas les carbapénèmes. La comparaison de la structure tri-dimensionnelle d’OXA-48 avec d’autres CHDLs a révélé de petites différences principalement localisées dans les boucles qui relient des éléments de structure. Notamment, la boucle localisée entre les feuillets b5 et b6 semble jouer un rôle majeur dans l’hydrolyse des carbapénèmes.Afin de mieux comprendre la contribution de la boucle b5-b6 dans l’hydrolyse des carbapénèmes, nous avons étudié, grâce à des outils biochimiques et structuraux, des variants naturels ou synthétiques d’OXA-48 présentant des modifications dans la boucle: le rôle du remplacement de chaque AA de la boucle par une alanine, des délétions croissantes ou de l’augmentation de la taille de la boucle. Nous avons également réalisé l’échange de boucle entre OXA-48 et OXA-18, une oxacillinase inhibée par l’acide clavulanique et hydrolysant fortement les C3G mais pas les carbapénèmes. La protéine recombinante OXA-48loop18 hydrolysait les C3G, et conservait une activité significative d’hydrolyse des carbapénèmes. L’échange de boucle a permis l’élargissement du site actif, permettant l’accès à des b-lactamines possédant un radical volumineux (e.g. ceftazidime). De plus, le remplacement de chaque AA de la boucle par une alanine a relevé de faibles changements hydrolytiques. En réalisant des délétions croissantes d’AA soit en partant de la gauche de la boucle (Tyr-211 vers Pro-217) ou de la droite (Pro-217 vers Tyr-211), nous avons montré que l’activité d’hydrolyse des carbapénèmes diminuait avec la taille des délétions, alors que celle des C3G augmentait. Les délétions de 4 AA présentent les plus fortes activités hydrolytiques des C3G et une perte totale de l’activité carbapénèmase, excepté pour le simple mutant, OXA-48∆P217, qui présentait un profile d’hydrolyse avec une forte activité carbapénèmase et C3G. La cristallographie et la modélisation moléculaire ont montré une grande flexibilité de la boucle, permettant l’entrée de b-lactamines de tailles variables. De plus, l’étude de nouveaux variants d’OXA-48 a permis d’identifier des déterminants structuraux importants dans le profil d’hydrolyse observé. Ainsi, la délétion I215-E216 associée à la substitution R214K dans la boucle b5-b6 de OXA-517 permet une forte hydrolyse des carbapénèmes et des C3G. De même, dans OXA-519, une substitution V120L située à proximité de la boucle b5-b6, a pour conséquence une diminution de l’affinité pour tous les substrats. La chaine latérale plus encombrante de la L120 empêche l’insertion des b-lactamines, diminuant l’affinité de l’enzyme. Finalement, nous avons caractérisé OXA-535, la b-lactamase naturelle et chromosomique de Shewanella bicestrii JAB-1 qui, n’ayant uniquement 91,5% d’identité en AA avec OXA-48, présente le même profil d’hydrolyse. OXA-535 présentait 98.9% d’identité en AA avec OXA-436, codé par un gène plasmidique, suggérant ainsi que S. bicestrii portant le gène blaOXA-535 pourrait être le progéniteur du gène plasmidique blaOXA-436.Nos travaux ont montré le formidable pouvoir d’adaptation de OXA-48 à évoluer par mutation afin d’accommoder différents substrats, et comment la nature et la longueur de la boucle b5-b6 pouvait influencer sur la spécificité de substrat.
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Contributor : Abes Star :  Contact
Submitted on : Monday, July 1, 2019 - 1:16:06 AM
Last modification on : Thursday, June 25, 2020 - 1:54:02 PM

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  • HAL Id : tel-02169206, version 2

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Maria Laura Belen Dabos. Structural and functional insights into the substrate specificity of OXA-48-like carbapenemases. Bacteriology. Université Paris-Saclay, 2018. English. ⟨NNT : 2018SACLS402⟩. ⟨tel-02169206v2⟩

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