Characterization of the diversity of the Polycomb group complexes Binding sites in Drosophila
Caractérisation de la diversité des sites de fixation des protéines du groupe Polycomb chez la Drosophile
Résumé
Polycomb group (PcG) complexes were initially discovered in Drosophila as transcriptionnal repressors of homeotic genes. To date, we know that they are involves in a large pleithora of biological processes including the maintenance of stem cells plasticity, differentiation, X chromosome inactivation and imprinting. PcG complexes are highly conserved from Drosophila to Humans and can be divided into two main complexes: PRC1 and PRC2 (Polycomb repressive complex 1 and 2). Both complexes have a histone modifying activity: PRC1 catalyses the mono-ubiquitination of the lysine 118 on histone H2A (H2AK118Ub) and PRC2 catalyses the tri-methylation of the lysine 27 on histone H3 (H3K27me3).In Drosophila, these complexes are recruited to cis regulatory elements named Polycomb Responsive Elements (PREs) that drive the epigenetic inheritance of silent chromatin states throughout development. Importantly, PcG complexes do not contain DNA-binding activity but are recruited to PREs via their interaction with Transcription Factors (TF) recognizing DNA motifs clustered at PREs. However the mechanism how PREs target PcG complexes is still not well understood due to the complexity of PcG recruitment, which is reflected at different levels: The DNA signature between PREs can differ significantly and several TF are implicated in PcG recruitment, but none of them is sufficient to recruit PcG complexes to PREs. Moreover PcG complexes can cooperate in different ways to stabilize each other’s binding. Finally, another layer of complexity is found at a more global level since PcG complexes do not only bind repressed sites, but they are also found at active regions.Therefore, our working hypothesis is that different classes of PREs exist in Drosophila. My PhD work was thus to define these different classes of PREs on a genome-wide scale and to functionally characterize them in order to get a complete molecular description of PRE function. Understanding how PcG complexes are recruited is of high importance, since deregulation of both, PcG complexes and their recruiting factors can led to cancer and diseases. My work led to the identification of six different classes of PREs that are characterized by different chromatin and genomic features. Interestingly the majority of PREs are associated with active genes that can be divided into housekeeping regulatory regions and developmental enhancers. In addition another class comprises bona fide chromatin domain boundaries. On the other hand PREs associated with repressed chromatin states shows features of previously described PREs and associate with repressed genes and PcG-associated histone marks. Finally another class comprises PREs that are likely in a poised chromatin state. We further demonstrated that PREs located at repressed and active regions differ in their combination of TF. In vivo analyses along with a transcriptomic analysis performed in cell lines mutated for a member of PcG complexes revealed that PcG complexes play a repressive role at both, active and repressed PREs.Taken together, our result suggest an unexpected heterogeneity of PREs and contributes to the better understanding of their characteristics and function.
Les protéines du groupe Polycomb (PcG) ont initialement été identifiées chez la drosophile comme répresseurs transcriptionnels des gènes homéotiques. Aujourd’hui, nous savons que ces protéines jouent un rôle bien plus large puisqu’elles régulent des gènes dont les produits sont impliqués dans de nombreux processus biologiques (régulation des gènes HOX, maintien de la plasticité des cellules souches, la différenciation cellulaire, l’inactivation du chromosome X, la régulation des gènes soumis à empreintes). Leur dérégulation est source de nombreux cancers chez l’homme. Hautement conservées, elles forment deux principaux complexes : PRC 1 et 2 (Polycomb repressive complex 1 and 2), dont l’activité est respectivement reflétée par la mono-ubiquitinylation de la lysine 118 l’histone H2A (H2AK118Ub) et la tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3). Chez la Drosophile, les sites de fixation de ces complexes sont appelés PRE (Polycomb Responsive Elements) où ils sont recrutés via des facteurs de transcription (FT).La complexité du recrutement des complexes du PcG, chez la Drosophile comme chez les mammifères, est visible à différents niveaux : au niveau de la séquence même de leurs sites de fixations, au niveau des facteurs de transcription qui les recrutent, au niveau de l’interface entre les deux complexes PRC1 et PRC2 et enfin au niveau global, part le présence de ces complexes au niveau de sites transcriptionnellement actifs. L’ensemble de ces résultats démontre clairement la nature hétérogène des PRE. Ces derniers diffèrent non seulement par leur séquence, mais également par les FT qui les recrutent et enfin par la manière dont les complexes PcG sont recrutés (PRC2 recrute PRC1 ou le contraire). Mon projet de thèse s’est donc dessiné autour d’une hypothèse : il existe différentes classes de PRE chez la Drosophile. Mon travail a donc consisté à définir ces différentes classes et à les caractériser pour en déduire des rôles spécifiques à l’échelle génomique. En effet, l’implication des complexes du PcG dans l’apparition de cancer chez l’Homme requière que l’on comprenne comment ces protéines sont recrutées à la chromatine.Mes travaux de thèse ont permis d’identifier six classes différentes de sites de fixation aux protéines du PcG. Nous avons retrouvé une classe correspondant aux sites de fixations canoniques fixés par les protéines du PcG et présents au sein de larges domaines répressifs marqués par H3K27me3. Une seconde classe correspond à des éléments de régulation marqués par un état de pause transcriptionnelle. De façon surprenante, nous avons démontré qu’une grande partie des sites de fixation des complexes du PcG était localisée au niveau de régions transcriptionnellement actives. Ces classes de PRE diffèrent en particulier en éléments génomiques qui les composent. Deux classes correspondent à des enhancers développementaux. Une classe correspond à des promoteurs actifs pouvant réguler des gènes de ménage. Enfin, une dernière classe correspond à des bordures de TAD. Les sites actifs et réprimés fixés par le PcG fixent également des combinaisons différentes de FT. Des analyses in vivo associées à un transcriptome réalisé à partir de cellules mutantes pour une protéine du PcG révèlent que les complexes du PcG jouent également un rôle de répresseur transcriptionnel au niveau des sites actifs. L’ensemble de ces résultats suggère une hétérogénéité inattendue des sites de fixation des complexes du PcG et permettra de mieux comprendre les caractéristiques liées à ces protéines dont la dérégulation mène à l’apparition de cancers chez l’Homme marqués par leur agressivité.
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