Identification and functional analysis of late effectors involved in systemic colonization of oilseed rape by Leptosphaeria maculans
Identification et analyse fonctionnelle des effecteurs tardifs impliqués dans la colonisation systémique du colza par Leptosphaeria maculans
Résumé
Leptosphaeria maculans is a pathogenic fungus, responsible for one of the main diseases of oilseed rape (Brassica napus), the stem canker disease. The infectious life cycle of L. maculans is especially complex. After the primary infection of leaves and cotyledons, the fungus develops a long endophytic stage in the stem. This infection stage, which is entirely asymptomatic, lasts several months before necrosis develops at the stem base, responsible of yield loss. At this stage, the oilseed rape may exhibit "adult resistance" limiting the onset and severity of symptoms. While the fungal genes expressed during the primary infection are extensively studied, very little knowledge was available concerning the systemic colonization. To explain the ability of the fungus to colonize the stem without inducing symptom, we have therefore hypothesized that L. maculans expressed effectors, i.e. small secreted proteins, interfering with the plant defense system.The objective of my thesis was to identify such effectors and to characterize them to better understand the systemic colonization of oilseed rape by L. maculans. One of the underlying challenges of this thesis was also to identify new resistances allowing the specific recognition of these effectors expressed during stem colonization, and which may explain, at least in part, the adult resistance observed in some varieties.Using a transcriptomic approach, I was able to identify 307 "late" effector candidates specifically expressed during stem colonization and 107 "early" effector candidates specifically expressed during cotyledon colonization. I confirmed that the genes encoding early effectors of L. maculans are specifically localized in gene-poor regions and rich in repeated elements of the fungal genome. Conversely, late candidate effectors are absent from these regions and are located in regions rich in genes of the genome. L. maculans effectors have thus a distinct genomic localization based on their expression profile.A detailed analysis of five of these late effectors showed their conservation in the natural populations of L. maculans and their involvement in the suppression of plant cell death. These results, associated with the analysis of their expression profile in stem samples from the fields during a growing season, allowed us to propose the following model: L. maculans would colonize systemically the oilseed rape stem by secreting effectors suppressing cell death and thus interfering with plant defenses. At the end of the growing season, the decreased expression of these effectors would allow the fungus to switch from a biotrophic to a necrotrophic lifestyle and to induce stem canker. This transition between the two ways of life would therefore be based on a balance between effectors suppressing and effectors inducing cell death.In order to identify new specific sources of resistance and / or to facilitate the identification of quantitative resistances in plant material, I created fungal strains over-expressing late effectors during cotyledon colonization. With these transformed strains I evaluated by cotyledonary test a large collection of oilseed rape genotypes to identify potential gene-for-gene. A variety with a hypersensitive response to a late effector was thus identified, the monogenic control of this response was validated and its genetic mapping carried out in two progenies. This approach therefore effectively enables the identification of new sources of resistance for effective control of L. maculans.
Leptosphaeria maculans est un champignon pathogène, responsable de l’une des principales maladies du colza (Brassica napus), la nécrose du collet. Le cycle de vie infectieux de L. maculans est particulièrement complexe. Après l’infection primaire des feuilles et des cotylédons, le champignon développe une longue phase de vie endophytique dans la tige. Cette phase de vie, qui est entièrement asymptomatique, dure plusieurs mois, avant que la nécrose ne se développe à la base de la tige, préjudiciable à l'élaboration du rendement. Durant cette phase, le colza peut présenter une « résistance adulte » limitant l'apparition et la gravité des symptômes. Alors que les gènes fongiques exprimés au cours de l’infection primaire du colza sont largement étudiés, très peu de connaissances étaient disponibles concernant la phase de colonisation systémique. Pour expliquer la capacité du champignon à coloniser la tige sans induire de symptômes, nous avons donc émis l’hypothèse que L. maculans exprimait à ce stade des effecteurs, c'est-à-dire des petites protéines sécrétées, interférant avec le système de défense de la plante. L’objectif de ma thèse était d'identifier de tels effecteurs et de les caractériser afin de mieux comprendre la colonisation systémique du colza par le champignon. Un des enjeux sous-jacents de cette thèse était aussi d'identifier de nouvelles résistances permettant la reconnaissance spécifique de ces effecteurs, qui pourraient expliquer, au moins en partie, la résistance adulte observée dans certaines variétés.Par une approche transcriptomique, j'ai pu identifier 307 effecteurs candidats "tardifs", spécifiquement exprimés lors de la colonisation de la tige et 107 effecteurs "précoces", spécifiquement exprimés lors de la colonisation des cotylédons. J’ai confirmé que les gènes codant des effecteurs précoces de L. maculans sont spécifiquement localisés dans les régions pauvres en gènes et riches en éléments répétés du génome fongique. A l'inverse les gènes codant des effecteurs candidats tardifs sont absents de ces régions et sont localisés dans les régions riches en gènes du génome. Les effecteurs de L. maculans ont donc une localisation génomique distincte en fonction de leur profil d'expression.Une analyse approfondie de cinq de ces effecteurs tardifs a permis de montrer leur conservation dans les populations naturelles de L. maculans et leur implication dans la suppression de la mort cellulaire végétale. Ces résultats associés à l'analyse de leur profil d'expression dans des échantillons de tige issus du champ au cours d'une saison culturale ont permis de proposer le modèle suivant: L. maculans coloniserait la tige de colza en sécrétant des effecteurs supprimant la mort cellulaire et donc interférant avec les défenses de la plante. A la fin de la saison culturale, la diminution de l'expression de ces effecteurs permettrait au champignon de passer d'un stade de vie biotrophe à un stade de vie nécrotrophe et d’induire la nécrose au collet. Cette transition entre les deux modes de vie serait donc basée sur un équilibre entre effecteurs supprimant la mort cellulaire et effecteurs induisant la mort cellulaire.Dans le but d'identifier de nouvelles sources de résistance spécifiques et/ou faciliter l’identification de résistances quantitatives dans le matériel végétal, j'ai créé des souches fongiques sur-exprimant précocement des effecteurs tardifs. Avec ces souches transformées j'ai évalué par test cotylédonnaire une grande collection de génotypes de colza pour identifier de potentielles relations de type gène-pour-gène. Une variété présentant une réponse hypersensible à un effecteur tardif a ainsi pu être identifiée, le contrôle monogénique de cette réponse a été validé et sa cartographie génétique effectuée dans deux descendances. Cette approche permet donc effectivement d'identifier de nouvelles sources de résistances pour lutter efficacement contre la nécrose du collet.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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