Development of the surface-enhanced infrared spectroscopic approach and surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with electrochemistry to study reaction mechanism of membrane proteins
Développement d'approches spectroscopiques infrarouge exaltées de surface et Raman couplée à l'électrochimie pour l'étude du mécanisme réactionnel des protéines membranaires
Résumé
This thesis concerns the development of surface-enhanced infrared and Raman spectroscopic approaches: surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) combined with perfusion cell and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) combined with electrochemistry. Within the first project different proteins were studied: Lactose Permease (LacY), complex I and IM30.The pKa of Glu325 in LacY WT and in different mutants carrying mutations in the proton translocation active center was determined. WT complex I was oxidized with different oxidizing agents and reduced with NADH. Corresponding redox-induced conformational changes were studied. The evidence was given that Mg2+ ions induce conformational changes in the protein IM30.Within the second project the spectroelectrochemical cell containing gold grid electrode was adopted for the studies of redox active proteins. This gold grid serves both as working electrode and as SERS active substrate. First Cyt c, Hb and Mb were used to validate the setup and then the approach was extended to study a membrane protein.
Cette thèse concerne le développement d’approches spectroscopiques infrarouge et Raman exaltées de surface: la spectroscopie infrarouge exaltée de surface (SEIRAS) combinée avec une cellule de perfusion et la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) couplée avec l’électrochimie. Dans le cadre du premier projet, différentes protéines ont été étudiées : lactose perméase (LacY), complexe I et IM30. Nous avons déterminé le pKa de Glu325 dans LacY sauvage et dans différents mutants portant des mutations dans le centre actif de translocation des protons. Sauvage complexe I a été oxydé avec différents agents oxydants et réduit avec NADH. Spectres différentiels correspondants ont été analysés. Des changements conformationnels dans la protéine IM30, induits par la présence des ions Mg2+, ont été observés.Dans le cadre du deuxième projet, une cellule spectroélectrochimique contenant une grille d’or a été adaptée pour étudier des protéines redox actives. Cette grille d’or sert à la fois de substrat SERS et d’électrode de travail. Cyt c, Hb et Mb ont d'abord été utilisés pour valider la configuration, puis l'approche a été étendue pour étudier une protéine membranaire.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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