Development and vectorization of CAL PDZ inhibiting peptides for the treatment of cystic fibrosis
Développement et vectorisation de peptides inhibiteurs du domaine PDZ de CAL pour le traitement de la mucoviscidose
Résumé
Cystic fibrosis is a lethal disease induced by genetic mutations of the CFTR chloride channel, leading to a loss of its function in the epithelial tissues of various organs. The lung is particularly affected and becomes a target for chronical bacterial infections. To cure the disease, we developed so-called CFTR “stabilizers”, which are peptides inhibiting the interaction between the CFTR protein and the key mediator of its half-life at the apical membrane of epithelial cells, the CAL protein. In particular, the iCAL36 peptide showed an increase of the functionality of the mutated CFTR protein. The aim of this thesis was to increase this biological effect by improving its pharmacological parameters: cellular internalization (vectorization), metabolic stability and affinity for the CAL protein.The first axis of optimization was the internalization of the iCAL36 peptide by 7 different cell-penetrating peptides (CPP). The corresponding conjugates were evaluated upon their cytotoxicity, their uptake efficiency and their capacity to maintain this efficiency in the presence of proteases. The mechanism of entry of the two best candidates was then studied. Various bias frequently encountered during the analysis of CPP uptake efficiency by fluorescence methods were also identified and explained. Afterwards, the iCAL36 sequence was modulated by inclusion of non-natural amino acids. The screening of the peptide/protein interactions was performed by a method optimized during this thesis (PIPEPLUS process) and allowed the identification of 32 promising analogues of the iCAL36 sequence including several substitutions. In particular, one of these sequences (iCAL-Q27) showed an affinity 70 times stronger for the CAL protein compared to iCAL36, hinting a more complete inhibition of the CAL/CFTR interaction.Overall, these major results grant the access to second-generation “stabilizers” potentially showing an improved biological effect in the context of cystic fibrosis.
La mucoviscidose est une maladie génétique létale induite par des mutations du canal ionique CFTR, provoquant une perte de sa fonctionnalité au niveau des tissus épithéliaux de divers organes. Le poumon est particulièrement touché et devient sujet à des infections bactériennes chroniques. Dans le but de traiter la maladie, nous avons développé des « stabilisateurs » de la protéine CFTR : il s’agit de peptides inhibant l’interaction de la protéine CFTR avec le médiateur-clé de sa demi-vie à la membrane apicale des cellules épithéliales, la protéine CAL. En particulier, le peptide iCAL36 a démontré une hausse de fonctionnalité de la protéine CFTR mutée. Le but de cette thèse a été de renforcer cet effet biologique en améliorant ses caractéristiques pharmacologiques : pénétration cellulaire (vectorisation), stabilité métabolique et affinité pour la protéine CAL.Le premier axe d’optimisation a été l’internalisation du peptide iCAL36 par 7 différents peptides vecteurs (CPP). Les conjugués correspondants ont été évalués suivant leur cytotoxicité, leur efficacité d’internalisation et leur capacité à maintenir cette efficacité en présence de sérum. Le mécanisme d’entrée des deux meilleurs conjugués a ensuite été étudié. Divers biais couramment rencontrés lors de l’analyse de l’efficacité d’internalisation de peptides vecteurs par des méthodes de fluorescence ont également été identifiés et expliqués. La séquence du peptide iCAL36 a ensuite été modulée par inclusion d’acides aminés non-naturels. Le criblage des interactions peptide/protéine a été réalisé par une procédure optimisée dans le cadre de cette thèse (méthode PIPEPLUS) et a permis d’identifier 32 analogues prometteurs de la séquence d’iCAL36 incluant différentes substitutions. En particulier, une des séquences identifiées (iCAL-Q27) a démontré une affinité 70 fois supérieure à celle du peptide iCAL36 pour la protéine CAL, indiquant une inhibition plus complète de l’interaction CAL/CFTR.Ces résultats majeurs permettent dans leur ensemble de développer des « stabilisateurs » peptidiques de seconde génération pouvant avoir un effet biologique accru dans le contexte de la mucoviscidose.
Origine : Version validée par le jury (STAR)