Study of the influence of structural modifications on the human neuroglobin
Étude de l’influence de modifications structurales sur la neuroglobine humaine
Résumé
The physiological function of Human Neuroglobin (Ngb), discovered in 2000, is still unknown. Compared to other classical globins Haemoglobin and Myoglobin, Ngb has some structural specificities. Its haem, which is its reactive centre, is hexacoordinated by distal histidine 64 and exists under two isomer forms A and B. Moreover, Ngb possesses an intramolecular disulfide bridge between two cysteines 46 and 55.The relationship between its structural characteristics and its functions in vivo does not remain well-understood. The goal of this thesis was to underline the impact of some structural features on the Ngb properties and reactivity in vitro. Thus Ngb variants H64V, F106L, A90P and C46G were produced. Experimental studies were performed by UV-Visible spectrophotometry, circular dichroism and NMR. Variants were characterized : their stability as a function of pH were tested and their reactivity trough the CN binding reaction were evaluated.We have shown that the Ngb structure was strongly dependant on the presence of the distal histidine, the disulfide bridge and the haem environment. The first and unique determination of variants’ molar absorption coefficients underlined the influence of the haem vicinity and disulfide bridge on the electronic haem environment. We have brought some evidence that the disulfide bridge and the mutated amino acids have an impact on the isomer A Ngb ability to bind the cyanide whereas isomer B is poorly affected by those two parameters. This phenomenon raises the issue of the existence and function of the two isomer forms in vivo.
La neuroglobine humaine (Ngb) est une globine découverte en 2000 dont la fonction principale demeure encore inconnue. Par comparaison avec l’hémoglobine (Hb) et la myoglobine (Mb), les globines les plus étudiées, la Ngb possède une séquence en acides aminés particulière. Il en résulte des caractéristiques structurales propres à la Ngb. L’hème, qui constitue le site actif de la Ngb, est hexacoordiné par l’histidine distale 64 et existe sous deux formes isomères A et B. La Ngb comprend également un pont disulfure Cys46-Cys55 intramoléculaire.La relation entre ces spécificités et d’éventuelles fonctions de la Ngb demeure cependant assez mal explorée. Notre objectif durant la thèse, était de mettre en évidence in vitro l’influence de différents éléments structuraux sur les propriétés et la réactivité de la Ngb. Pour ce faire, les mutations H64V, F106L, A90P et C46G ont été réalisées. Des études expérimentales à l’aide de spectrophotométrie UV-visible, de dichroisme circulaire et de RMN, ont été effectuées pour caractériser les mutants synthétisés, tester leur stabilité en fonction du pH et évaluer leur réactivité vis-à-vis de la fixation du ligand CN.Nous avons ainsi montré que la structure de la Ngb était influencée par la présence de l’histidine distale, du pont disulfure et de l’environnement de l’hème. L’étude, pour la première fois, des coefficients d’extinction molaire des protéines mutées a permis de souligner l’impact des acides aminés au voisinage de l’hème mais aussi du pont disulfure sur l’environnement électronique de l’hème. Nous avons aussi mis en évidence que le pont disulfure et les acides aminés mutés influaient sur la capacité de la forme isomère A de la Ngb à fixer le cyanure. La forme isomère B est en revanche peu impactée par ces deux paramètres. Cela soulève la question de l’existence et de la fonction des deux formes isomères de l’hème in vivo.
Origine : Version validée par le jury (STAR)