Structural, dynamical and functional study of the proteasome activating complex (PAN)
Etude de la structure et du mécanisme d’action du complexe unfoldase PAN, un activateur du protéasome 20S
Résumé
Intracellular protein degradation is a fundamental process occurring in all organisms, from bacteria to human. The continual degradation of proteins is necessary for regulating the intracellular levels of enzymes that control all metabolic reactions, as well as the general content of all other proteins, in response to physiological changes. A state of a dynamic equilibrium is created where the intracellular concentration of a protein can be modulated by changes in the synthesis rate as well as the degradation rate. The work presented in this thesis deals with the proteasome activating complex from archaeal cells (PAN). PAN is an energy dependent hexameric complex discovered in archaea and involved in the unfolding of protein substrates to facilitate their degradation by the 20S proteasome. All the previous structural studies on the assembled PAN complex have failed in revealing the structure of the whole complex because of the difficulties encountered during sample preparation and stabilization. In the first part of this work we determined a Cryo-electron microscopy structure and a pseudo-atomic model of the hexameric PAN complex from Pyrococcus horikoshii. In addition, the study of the different conformational states of the PAN complex induced by nucleotide binding helped in gaining several information about the AAA+ unfoldases mechanism and to propose a mode of action of the PAN complex. The second part of the study led to elucidate the question about the dynamic and the conformational changes of the AAA+ unfoldases in general and the PAN complex in particular. The method of contrast variation in Small Angle Neutron Scattering (SANS) coupled with online fluorescence spectroscopy applied to study, in real-time, the substrate unfolding process by the PAN complex from Methanococcus jannaschii allowed to reveal, for the first time, a contraction movements of PAN during substrate unfolding induced by ATP hydrolysis and followed by a relaxation of the molecule at the end of the process. The unfolding mechanism processed by PAN appears to be a peristaltic pumping motion that leads to a directional unfolding of the substrate. The whole work presented in this thesis contributes in understanding the structure and the mechanism of action of the PAN molecular machine inside the cells and to have a clearer idea about the functional dynamics of the AAA+ complexes at the origin of their biological functions.
La dégradation intracellulaire des protéines est un processus fondamental qui a lieu dans tous les organismes, depuis les bactéries jusqu’aux êtres humains. La dégradation continuelle des protéines est nécessaire pour réguler les concentrations intracellulaires d’enzymes qui contrôlent toutes les réactions métaboliques, ainsi que le contenu général de toutes les autres protéines, en réponse aux modifications physiologiques. Un état d’équilibre dynamique se crée ainsi où la concentration intracellulaire d’une protéine peut être modulée aussi par des modifications de la vitesse de dégradation et de la vitesse de synthèse. Le travail présenté dans cette thèse porte sur le complexe d’activation du protéasome des cellules d’archaea (PAN). PAN est un complexe hexamerique énergie-dépendant découvert chez les archaeas et impliqué dans le dépliement des protéines substrat pour faciliter leur dégradation par le protéasome 20S. Toutes les études structurales du complexe PAN assemblé n’ont pas réussi à révéler la structure de la protéine à cause des difficultés rencontrées au niveau de la préparation et la stabilité des échantillons. La première partie du travail présenté a permis de déterminer une structure par Cryo-microscopie électronique et un modèle pseudo-atomique du complexe PAN hexamerique de Pyrococcus horikoshii. De plus, l’étude des différents états conformationnels du complexe induits par liaison du nucléotide ont permis de gagner plusieurs informations sur le mécanisme des unfoldases AAA+ et de proposer un mode d’action du complexe PAN. La seconde partie de l’étude a conduit à élucider la question sur la dynamique et les changements conformationnels des systèmes AAA+ unfoldases en général et du complexe PAN en particulier pendant le dépliement des protéines substrats. La méthode de variation de contraste en diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) couplée avec de la spectroscopie de fluorescence appliqué à l’étude en temps réel du processus de dépliement de substrat par le système PAN de Methanococcus jannaschii a permis de révéler, pour la première fois, des mouvements de contraction de PAN pendant le dépliement du substrat induits par l’hydrolyse de l’ATP et suivis par une relaxation de la molécule à la fin du processus. Le mécanisme de dépliement par PAN semble être un mouvement de pompage péristaltique qui entraine un dépliement directionnel du substrat. L’ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre la structure et le mécanisme d’action de la machine PAN dans les cellules et d’avoir une idée plus claire sur la dynamique fonctionnelle des complexes AAA+ à l’origine de leurs fonctions biologiques.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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