Études structurales de la dynamique de protéines fluorescentes vertes et jaunes utilisées en imagerie cellulaire

Résumé : Les protéines fluorescentes (PF) homologues d’AvGFP (Green Fluorescent Protein de la méduse Aequorea victoria) sont des outils incontournables de l’imagerie des processus de la cellule vivante. Leurs performances conditionnent la précision de l’analyse quantitative des signaux de fluorescence. Le développement de nouvelles PF demande donc à la fois de parvenir à une forte brillance tout en contrôlant la réponse de la protéine aux variations des paramètres physico-chimiques de la cellule en fonction de la question biologique étudiée. A ce jour, les PF jaunes disponibles montrent une forte sensibilité au pH. Afin d’élaborer des mutants moins sensibles, deux approches ont été considérées : une première consiste à mieux appréhender l’incidence de la dynamique du réseau de liaisons hydrogène entourant le chromophore sur son équilibre acido-basique. La seconde vise à identifier les facteurs structuraux à l’origine de la brillance particulièrement élevée de nouvelles PF jaunes et jaune-vert provenant d’un ver marin, Branchiostoma lanceolatum.J’ai d’abord mis au point un algorithme recherchant l’ensemble des liaisons hydrogène présentes au sein d’une protéine et qui étudie leur dynamique au cours de simulations par dynamique moléculaire. Il permet leur agrégation en réseaux, l’identification des réseaux connectés à un atome d’intérêt ainsi que le suivi de leur dynamique. Pour validation, cet algorithme a été appliqué à la recherche des réseaux de liaisons hydrogène présents au sein de différents mutants d’AvGFP pour lesquels un transfert de proton à l'état excité a été étudié expérimentalement. Cet algorithme pourra également servir à comprendre de façon dynamique le mécanisme d’autres systèmes biologiques dont la fonction repose sur le transfert de protons.D’autre part, j’ai résolu la structure de la protéine fluorescente jaune naturelle lanYFP de Branchiostoma lanceolatum, particulièrement brillante mais à la structure quaternaire tétramérique. Cette protéine a été rendue monomérique par évolution dirigée, ce qui a donné la protéine mNeonGreen à la fluorescence jaune-vert, protéine désormais étalon dans cette gamme spectrale, et dont j’ai également résolu la structure. Mon étude a permis de rationaliser a postériori l’ensemble des mutations introduites au cours de l’évolution. Enfin, j’ai réalisé une étude du dégât d’irradiation spécifique des rayons X permettant de comprendre le changement remarquable de couleur observé sur les cristaux de mNeonGreen après collecte de données de diffraction.L’ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse permet de proposer un cadre de compréhension à la fois théorique et expérimental des déterminants contrôlant les propriétés de fluorescence des PF jaunes.
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Thèse
Cristallographie. Université Paris-Saclay, 2016. Français. <NNT : 2016SACLS491>


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Soumis le : lundi 13 février 2017 - 16:59:07
Dernière modification le : samedi 18 février 2017 - 01:11:32

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Damien Clavel. Études structurales de la dynamique de protéines fluorescentes vertes et jaunes utilisées en imagerie cellulaire. Cristallographie. Université Paris-Saclay, 2016. Français. <NNT : 2016SACLS491>. <tel-01466736>

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