Development of a SELEX method to uncover auto-aminoacylating ribozymes and analysis of aminoacyl RNA from Escherichia coli transcriptomes
Développement d'une méthode SELEX pour l'identification de ribozymes pour l'aminoacylation et analyse d’ARN aminoacylés dans le transcriptome d'Escherichia coli
Résumé
Ribozymes are natural or in vitro selected RNA molecules possessing a catalytic activity. Artificial ribozymes have been extensively investigated by in vitro SELEX experiments, and characterized by kinetic assays. Ribozymes are involved in RNA cleavage, ligation, capping, polymerization, phosphorylation and acyl activation. Because it is required for translation, RNA aminoacylation plays an important role in the evolution from the late RNA world to the modern DNA and protein world, and is central to the genetic code. Several ribozymes catalyzing amino acid transfer from various activating groups have already been selected and characterized in the past two decades, documenting the possibility of tRNA aminoacylation in the absence of aminoacyl tRNA synthetase. With a newly designed SELEX protocol based on periodate oxydation, the aim of our investigation is to uncover small ribozymes of the order of 20 nucleotides that could catalyze both amino acid activation and transesterification. Although molecules catalyzing either reaction have been identified, no existing ribozyme could use free amino acids and activating cofactor(s) as substrates for 3' esterification in a single reactional context. The selection of active molecules in a SELEX procedure requires the presence of constant tracks on both ends of the sequences constituting the initial random pools. These tracks are required for PCR amplification, but they impose significant burden to the identification of ribozymes because they can prevent any activity through structural inhibition. We present an optimized protocol that significantly minimizes the size of these constant tracks. At the same time, our newly design protocol is very specific for the selection of 3'-end aminoacylated RNA. Working with this protocol, we performed 6 to 7 cycles of selection with different pools, and observed an enrichement with specific sequences. Although some experiments performed with entire pools did reveal a possible activity, no activity could be so far confirmed with specific sequences. A similar protocol was also applied in a parallel study to identify aminoacylated RNA from total RNA in Escherichia coli. In this other approach, our goal is to possibly identify new classes of aminoacylated RNA while using the deep sequencing technology. Using tRNA to validate our protocol, we realized that a standard RNAseq procedure could not work due to the presence of modified bases. We established a new method for bank preparation to identify any sequence aminoacylated at the 3' end. Ultimately, this new approach will allow us to study the level of aminoacylation of any sequence present in total RNA.
Les ribozymes sont des ARN naturels ou artificiels possédant une activité catalytique. Les ribozymes artificiels ont été identifiés in vitro par la méthode SELEX, et plusieurs d'entre eux ont été caractérisés par des études cinétiques. Ces molécules sont impliquées dans des réactions de clivage, de ligation, de modification d'extrémités d'ARN, de polymérisation, de phosphorylation et d'activation de groupements acyl. Parce qu'elle est nécessaire à la traduction, l'aminoacylation des ARN joue un rôle évolutif important dans la transition du monde de l'ARN vers le monde moderne de l'ADN et des protéines, et elle est centrale à l'établissement du code génétique. Plusieurs ribozymes catalysant le transfert d'acides aminés à partir de cofacteurs activants ont pu être isolés et caractérisés depuis une vingtaine d'années, ce qui a documenté la possibilité d'aminoacylation d'ARNt en l'absence des aminoacyl ARNt synthétases. En développant un nouveau protocole SELEX basé sur l'oxydation au périodate, le but de notre travail est de découvrir de nouveau ribozymes d'une taille de l'ordre d'une vingtaine de nucléotides pouvant combiner la catalyse de l'activation des acides aminé et la transestérification. Bien que des molécules catalysant l'une ou l'autre des deux réactions ont été identifiées, aucun ribozyme n'existe à ce jour qui puisse utiliser des acides aminés libres et un cofacteur activant pour réaliser l'aminoacylation en 3' dans un même milieu réactionnel. La sélection de molécules actives dans une approche SELEX exige la présence de régions constantes sur les deux extrémités des séquences pools aléatoires initiaux. Ces régions sont nécessaires pour l'amplification par PCR, mais elles imposent des contraintes importantes pour l'identification de ribozymes car elles peuvent complètement inhiber leur activité par interférence structurelle. Nous présentons un protocole optimisé qui minimise la taille de ces régions constantes. D'autre part, notre nouveau design est très spécifique pour la sélection d'ARN aminoacylés sur l'extrémité 3'. Ce protocole a été utilisé pour réaliser 6 à 7 cycles de sélection avec différents pools, et un enrichissement en séquences spécifiques a pu être mis en évidence. Bien que certains tests avec les pools sélectionnés a révélé une activité possible, des essais avec des séquences spécifiques de ces pools n'ont pour l'instant pas pu confirmer l'activité catalytique recherchée. Un protocole basé sur le même principe de sélection a été utilisé dans une étude parallèle pour identifier les ARN aminoacylés présents dans l'ARN total d'Escherichia coli. Dans ce deuxième travail, note but est d'identifier tous les d'ARN aminoacylés par séquençage massif, avec à la clé la découverte possible de molécules autres que les ARNt et ARNtm. En utilisant les ARNt comme modèle, nous nous sommes aperçus qu'un protocole RNAseq standard n'était pas adapté à cause des bases modifiées présentes sur ces molécules. Nous avons développé et mis au point un nouveau protocole pour l'identification de n'importe quelle séquence aminoacylée en 3'. La nouvelle approche présentée devrait permette l'étude exhaustive de l'aminoacylation de toutes les séquences présentes dans l'ARN total.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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