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Theses

Developement of strategies for the isotopic labeling of methyl groups for the NMR study of large protein assemblies

Résumé : Durant longtemps la spectroscopie RMN en solution a été limitée à de petits objets biologiques. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la stratégie du marquage isotopique spécifique de groupements méthyle dans une protéine perdeutérée a considérablement repoussé la frontière de cette technique. En effet, des protéines aussi grande que 1 MDa ont pu être récemment étudiées par RMN. Cependant, cette stratégie présente un inconvénient important lié au nombre réduit de sondes protonées. Dans ce contexte, le projet de thèse vise a développer de nouvelles méthodes pour faire face à cette rareté d'information structurale, en s'appuyant sur le marquage simultané (combinatoire) de plusieurs groupements méthyle afin d'augmenter le nombre de sondes. Pour un marquage combinatoire optimal, le choix des acides aminés à marquer et les précurseurs à utiliser ainsi que le protocole de leur incorporation doit être judicieusement étudié. Dans le présent travail, un nouveau protocole a été mis en place pour un marquage AbId1(LV)proS optimisé, exempt de toutes fuites isotopiques. En comparaison avec le marquage “AbId1LV standard", le modèle proposé permet la diminution d'un facteur de 2 le nombre de signaux RMN des Leu et Val et améliore par un facteur de 4 l'intensité des nOes à long portée qui sont expérimentalement détectable. Par ailleurs, ce protocole permet également la suppression des corrélations parasites, particulièrement nocives pour les études structurales basées sur la détection / analyse de nOes. Afin d'exploiter les spectres RMN obtenus en utilisant le protocole ci-dessus mentionné, l'attribution des signaux des méthyles est obligatoire. Deux stratégies ont été donc proposées. La première s'applique aux systèmes dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 100 kDa (e.g. MSG). Elle se repose sur la linéarisation du marquage isotopique des acides aminés permettant ainsi l'utilisation de l'expérience 13C-TOCSY pour attribuer de manière régio et stéréo-spécifique les méthyles de l'isoleucine, leucine et valine en une seule étape. En ce qui concerne la seconde, adaptée aux protéines supra-moléculaire (> 100 kDa), c'est une optimisation de l'approche SeSAM (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis) précédemment décrite dans la littérature. En effet, grâce au milieu de culture enrichi, mit au point pour le marquage spécifique de l'Ala, le volume minimal de culture requis a été considérablement diminué. Ceci a permis par conséquence de produire les protéines dans des plaques de 24 puits et de les purifier dans des plaques de 96 puits, raccourcissant ainsi le temps global de préparation des échantillons. Il a été estimé que l'utilisation de cette version améliorée de SeSAM offre la possibilité d'attribuer environ 100 méthyles en 2 semaines, dont 4 jours de temps de RMN, en consommant moins de 2 k € de matériaux isotopiques. Pour illustrer la pertinence du marquage isotopique et la protonation sélectifs des méthyles, de façon combinée ou pas, de nombreuses applications ont été présentés, à savoir l'étude en temps réel des processus d'auto-assemblage d'une protéine supramoléculaire (PhTET-2, ~ 0,5 MDa) par RMN. Le marquage combinatoire des protéines (82 kDa et 0,5 MDa) pour la détection de nOes longue portée (jusqu'à 10 Å et 8 Å respectivement) a également été étudié. Cette même approche a également été utilisée pour le filtrage de nOes inter-monomères à long portée, qui sont particulièrement importants pour le calcul de structure, dans des systèmes symétrique et homo-oligomèriques (PhTET-2).
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Contributor : Abes Star :  Contact
Submitted on : Sunday, July 10, 2016 - 7:49:08 PM
Last modification on : Wednesday, July 15, 2020 - 1:02:03 PM

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  • HAL Id : tel-01343865, version 1

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Rime Kerfah. Developement of strategies for the isotopic labeling of methyl groups for the NMR study of large protein assemblies. Biomolecules [q-bio.BM]. Université de Grenoble, 2014. English. ⟨NNT : 2014GRENV043⟩. ⟨tel-01343865⟩

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