Detection of HCV RNA sequences in Aedes mosquitoes' extracts: Kinetic study after experimental infections
Détection de séquences d'ARN du VHC dans des extraits de moustiques du genre Aedes : Etude cinétique après infections expérimentales
Résumé
Abstract: In order to explore the ability of mosquitoes to replicate HCV, we conducted a series of experimental
infections (four investigations spread between 2006 and 2009) on two different types of mosquito; Aedes
(Aedes (Ochlerotatus) caspius Pallas 1771; Aedes (Aedimorphus) vexans Meigen 1830) and Culex Culex
(Culex) pipiens Linnaeus 1758 wild (Ae. vexans, Ae. caspius Cx. pipiens) and lab adapted (Ae. vexans). After
collecting mosquitoes, females aged between 5 and 10 days were fed by a viremic blood meal, a mixture of
sheep (or rabbit) red blood cells and serum of patients infected with HCV (genotype 1b). The mosquitoes
were then maintained in breeding for several days (15 to 30 days) by making sampling points to monitor
the infection. After development of all stages upstream of the detection conditions (milling and extraction,
kits for use…) and detection conditions (choice of method of amplification and detection, kits for use ...)
We succeeded to provide evidence of HCV replication in the mosquito Aedes vexans. In the first
experimental infection, which lasted three weeks and performed on Ae. vexans, we detected HCV RNA in
~50% of mosquitoes of the 21st days post-infection (DPI), by endpoint PCR. The second infection
experiment, conducted on two types of mosquitoes: Aedes sp. and Culex pipiens, has allowed us to: (i)
confirmation – by qRT-PCR – the results of the first experiment (presence of HCV RNA in the mosquito
Aedes sp. 21 DPI) with an infection rate of ~33%; (ii) demonstrate that only Aedes mosquitoes contained
HCV RNA, the Culex mosquitoes were all negative, (iii) show that the RNA detected was issued from
replication, since adaptive mutations were identified in the sequence of the RdRp (RNA dependent RNA
polymerase), Val262 → Ala262, Pro265 → Ser265, and Asn316 → Asp316, with a specificity for the genus of
Aedes, since – once again – all Culex mosquitoes at 21 DPI were HCV RNA-negative. Another way to
distinguish replication originated RNA from residual RNA was to show dissemination of the virus in
different mosquito’ tissues. To do this, we conducted a third experimental infection (on Ae. caspius and Ae.
vexans), over a period of 15 days and analyzed the presence of HCV RNA separately in the heads and
bodies (previously separated by dissection). In conducting samples at different times after infection (0, 4,
8 and 15 days), we succeeded to obtain a kinetics of infection separately in heads and bodies, detection
performed by WTA (whole transcriptome amplification) followed by qPCR. On the day of infection (D0),
the infection rate in the heads and bodies of mosquitoes was 9.1% and 100% respectively, the rate rose to
57.1% and 85.7% respectively at 15 DPI, after it has been totally negative after eight days post-infection.
On the other hand, we have identified adaptive mutations in the IRES sequence of mosquito at 15 DPI
compared to those of day 0. It is interesting to note that HCV RNA-positive mosquitoes all belonged to the
vexans species, showing that replication is species specific. Different regions of the HCV genome were
then, amplified. Finally, we made use of lab adapted mosquitoes (lab strain Ae. vexans KK, Team AB
Failloux, Bunyavirus Molecular Genetics, Institute Pasteur - Paris). Infection of this strain has also shown,
using different approaches for detection (qRT-PCR, qPCR-WTA, HCV-GA namely), that HCV RNA was
present at 30 DPI in ~33% of heads and ~66% of the mosquito’ bodies, while infection rates were at
~28% and ~ 71% in the head and body respectively at 0 DPI. These results were based on sequencing
performed on the amplified regions of the HCV genome. Taken together; these results show that HCV is
able to replicate in Ae. vexans mosquitoes, suggesting that HCV, like other flaviviruses, can alternate
between two hosts (primates and mosquitoes) and has lost its potential for replication in the mosquito
over time, the primate providing a more stable replication environment (longer lifetime).
dans la séquence de la RdRp (ARN Polymérase ARN dépendante), Val262→Ala262, Pro265→Ser265, et
Asn316→ Asp316, avec une spécificité pour le genre Aedes, puisque tous les moustiques Culex à 21 JPI
étaient ARN VHC-négatifs. Un autre moyen de distinguer l’ARN issu de la réplication de l’ARN résiduel a
été de montrer l’existence d’une dissémination au sein du moustique. Pour ce faire, nous avons réalisé une
troisième expérience d’infections (genres Ae. caspius et Ae. vexans), sur une durée de 15 jours et avons
analysé la présence de l’ARN du VHC distinctement dans les têtes et les corps (préalablement séparés par
dissection). En effectuant des prélèvements à différentes dates après infection (0, 4, 8 et 15 jours), nous
avons réussi à obtenir une cinétique d’infection, séparément, dans les têtes et dans les corps, détection
réalisée par WTA (Whole Transcriptome Amplification) suivie de qPCR. Au jour de l’infection (J0), le taux
d’infection dans les têtes et les corps des moustiques était de 9,1% et 100% respectivement, ce taux est
passé à 57,1% et 85,7% respectivement à J15 après une négativation huit jours après infection. D’autre
part, nous avons identifié des mutations d’adaptation dans la séquence de l’IRES des moustiques à J15
comparés à ceux à J0. Il est intéressant de noter que les moustiques ARN VHC-positifs appartenaient tous à
l’espèce vexans, montrant ainsi que la réplication est spécifique d’espèce. Différentes régions du génome
du VHC ont, ensuite, étaient amplifiées. Enfin, nous avons eu recours à des moustiques d’élevage, adaptés
aux conditions de laboratoire (souche d’élevage Ae. vexans KK, équipe A-B Failloux, Génétique Moléculaire
des Bunyavirus, Institut Pasteur - Paris). L’infection de cette souche a également montré, en utilisant
différentes approches de détection (qRT-PCR, WTA-qPCR, HCV-GA notamment), qu’à 30 JPI, l’ARN du VHC
était présent dans ~33% des têtes et ~66% des corps, alors que les taux d’infection à J0 étaient de ~28%
et ~71% dans les têtes et les corps respectivement. Les résultats se sont appuyés sur des séquençages
effectués sur les régions amplifiées du génome du VHC. L’ensemble de ces résultats montrent que le VHC
est capable de se répliquer dans les moustiques du genre Ae. vexans, ce qui suggère que le VHC, à l’image
d’autres Flavivirus, puisse alterner entre deux hôtes (primates et moustiques) et qu’il ait perdu son
potentiel de réplication chez le moustique au fil du temps, le primate lui fournissant un environnement de
réplication plus stable (durée de vie plus longue).
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Virologie
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