Study of the interaction between two nuclear proteins: RevErbα/N-Cor by fluorescent techniques (anisotropy and microscopy)
Étude de l'interaction de protéines nucléaires: RevErbα/N-Cor par des techniques de fluorescence (anisotropie et microscopie)
Résumé
Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6P (Glucose-6-Phosphate) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). We choose to study the interaction of the RN with SMRT because of sequences similarity between the two corepressors and also because they are most of the time interacting with the same nuclear receptor. On the other hands, several studies reveled that SMRT and RevErbα are not interacting in vivo. But peptides from this proteins associate in vitro. To study these interactions, we use two complementary fluorescence techniques: Number & Brightness and fluorescence anisotropy to investigate the effect of several ligands on this interaction. Three ligands will be tested: heme which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetics and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed an interaction between RevErbα and an NCor peptide and reveal the effect of the three ligands on this interaction. We also study the interaction between RevErbα and several peptides from NCor corresponding to the necessary domains for it binding to RevErbα. We succeed to determine affinity constants for these interactions. We demonstrate, as well the destabilizing effect of heme binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro. We also confirm an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor. In order to confirm the functional relevance of these results, we used 2 photons 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an imaged-based fluorescence fluctuation technique (Digman et al, 2008) to study specific interactions of RevErbα with NCor and SMRT full length in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. We show for the first time a specific interaction between RevErbα and SMRT corepressor full length in cellulo. The ultimate goal of those studies is to identify ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target gene. Such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.
Les récepteurs nucléaires sont membres d’une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce dernier joue un rôle important dans le contrôle de l’horloge circadienne et de la glucogénèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Celles-ci sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l’investigation de l’interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs : son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c’est-à-dire que SMRT et RevErbα n’interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisi d’étudier cette interaction à cause de la similarité de séquences entre les deux corépresseurs, mais également parce que des peptides issus de SMRT se lient à RevErbα in vitro. Afin d’étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l’émission de fluorescence : l’anisotropie de fluorescence in vitro et la N&B in cellulo. L’effet de trois ligands a également été étudié sur ces interactions : l’hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l’anisotropie de fluorescence, nous avons confirmé et quantifié l’interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d’interaction majeur pour RevErbα et nous avons déterminé l’effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l’interaction entre RevErbα et d’autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d’interaction nécessaires pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l’hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur, alors que le ligand SGN améliore la stabilité des complexes in vitro. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et deux peptides corépresseurs issu de SMRT. Afin d’étudier les interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2-photons-2-couleurs Number & Brightness. C’est une technique de microscopie basée sur la fluctuation de l’intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l’effet des ligands, précédemment mentionnés, sur ces interactions. Nous démontrons pour la première fois l’interaction spécifique de RevErbα avec SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l’identification de ligands qui augmenteraient le recrutement de complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l’expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d’un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2.