Triazole multi-ligation : Development of new tools for the synthesis of protein analogues through successive cycloadditions
La multi-ligation triazole : Développement de nouveaux outils pour la synthèse de mimes de protéines par cycloadditions successives
Résumé
The aim of this work was the development of a novel method for the synthesis of triazolo-proteins by multiple successive copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions (CuAAC).
In order to achieve several successive cycloadditions, we have studied the stability and cleavage conditions of several alkyne protective groups. This study led us to the development of an original strategy in order to achieve three successive cycloadditions on a same scaffold by temporal protection of alkyne functionalities.
The method has been applied to the synthesis of an analogue of human stefin A, a natural inhibitor of several therapeutically relevant cysteine proteases. Therefore, we have developed CuAAC conditions compatible with unprotected peptide ligation. The strategy allowed us to obtain a bis-triazolo analogue of human stefin A. Circular dichroism and enzymology assays on several cysteine cathepsins revealed that the synthetic analogue has retained the folding and full biological activity of the native protein.
In order to expand the possibilities of this strategy, we have developed reaction conditions allowing us to perform successive triazole ligation on solid phase. This methodology avoids the need for a time-consuming and labor-intensive purification step before and after each ligation. With the aim of exploring the use of analogues of the tumor-associated form of the glycoprotein MUC1 to induce a specific immune response, we have synthesized a triazolo-analogue of MUC1 of 160 aminoacids using solid phase peptide ligation.
Ce travail est consacré au développement d’une nouvelle méthode de synthèse d’analogues bioactifs de protéines en utilisant des réactions successives de cycloaddition entre les alcynes terminaux et les azotures (CuAAC).
Pour pouvoir effectuer des cycloadditions itératives, nous avons étudié la stabilité et les conditions de coupure de différents groupements masquants des alcynes terminaux. Cette étude a été valorisée par le développement d’une stratégie originale pour réaliser un triple cycloaddition successive une même molécule basée sur la protection temporaire de la fonction alcyne.
La méthode a été appliquée à la synthèse d'un analogue de la stéfine A humaine, un inhibiteur naturel de protéases à cystéine d’intérêt thérapeutique. Pour cela, nous avons mis au point des conditions de CuAAC successive compatibles avec des peptides déprotégés de façon beaucoup à obtenir in fine un analogue bis-triazole de la stéfine A. Les études par dichroïsme circulaire et d’inhibition de diverses protéases à cystéines confirment que notre analogue synthétique conserve la structure et l’activité biologique de la protéine native.
La stratégie de ligation triazole successive a été étendue par la mise au point de conditions pour réaliser des ligations sur phase solide. La méthodologie développée permet la synthèse de protéines de façon plus rapide et plus simple que par des procédés classiques de ligation successive en solution. Dans l’optique de la synthèse de structures glycopeptidiques capables d’induire une réponse immunitaire contre MUC1 tumorale, nous avons réalisé la synthèse d’analogues peptidiques de MUC1 par ligation successive sur phase solide de 160 acides aminés
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