Developing new tools and platforms for mammalian synthetic biology: From the assembly and chromosomal integration of complex DNA circuits to the engineering of artificial intercellular communication systems
Développement de nouveaux outils et plateformes pour la biologie de synthèse des mammifères: de l'assemblage et l'intégration chromosomique de circuits d'ADN complexes à l'ingénierie de systèmes de communication artificiels
Résumé
Mammalian synthetic biology may provide novel therapeutic strategies, help decipher new paths for drug discovery and facilitate synthesis of valuable molecules. Yet, our capacity to program cells is currently hampered both by the lack of efficient approaches to streamline the design, construction and screening of synthetic gene networks, and also by the complexity of mammalian systems and our poor understanding of cellular processes context-dependencies. To address these problems, I proposed and validated a number of concepts and approaches during my PhD.
First, I created a framework for modular and combinatorial assembly of functional (multi)gene expression vectors and their efficient and specific targeted integration into a well-defined chromosomal context in mammalian cells. The potential of this framework was demonstrated by assembling and integrating different functional mammalian regulatory networks including the largest gene circuit built and chromosomally integrated to date (6 transcription units, 27kb) encoding an inducible memory device. Such a rapid and powerful prototyping platform is well suited for comparative studies of genetic regulatory elements, genes and multi-gene circuits as well as facile development of libraries of isogenic engineered cell lines.
Second, I developed a platform to identify and characterize new serine recombinase systems from Mycobacteriophage genomes in order to extend the toolbox of genome engineering tools available for mammalian cells programing. I validated the approach by identifying 26 new large serine recombinases from 400 Mycobacteriophage genomes, from which 4 were using new recombination sites. These recombinases could mediate site-specific recombination events in both E. coli and mammalian cells. Additionally, I demonstrated that a library of 6 orthogonal recombination site pairs could be engineered for each of these recombinases.
To overcome the apparent limitations in our single-cell rational engineering capacity, I also engineered two new artificial intercellular communication systems for mammalian cells, in order to facilitate the spatial decoupling of different modules of a synthetic circuit. The first one consists in synthetic sender/receiver modules that can be either integrated within the same cell population to create an autocrine-like system or integrated into two distinct populations of cell to create a paracrine-like system. To create the sender module, I assembled and stable integrated a synthetic metabolic pathway using different plants enzymes to produce a small diffusible molecule: phloretin. This small molecule, orthogonal to endogenous signaling pathways, can be sensed by the receiver module I engineered, which relies on a de-novo synthetic inducible gene expression system combining bacterial and mammalian genetic parts.
Based on previous development of Virus Like Particles (VLPs), I created a second intercellular communication system which enables the transfer of proteins from a sender cell population to a separate receiver cell population. I demonstrated that I could induce the budding of particles carrying recombinases (Cre and B3) from senders cell that could be delivered to the receiver cells and perform a targeted genomic rearrangement to activate transgene expression.
Even though we are still years away from therapies using engineered cells carrying synthetic circuits to repair damaged or non-functional organs or to create de-novo tissues, I believe the contributions developed during the course of my PhD could potentially be used to push mammalian synthetic biology forward, whether it is by helping fasten the development of therapeutically relevant synthetic circuits or by providing new means to better understand the underlying mechanisms of cellular processes.
La biologie synthétique des mammifères peut potentiellement offrir des stratégies thérapeutiques nouvelles, aider à identifier de nouvelles voies pour la découverte de médicaments et faciliter la synthèse de molécules d’intérêt. Malheureusement, notre capacité à programmer les cellules mammifères est actuellement limitée par le manque d’approches efficaces pour rationaliser la conception, la construction, et l’identification de réseaux génétiques synthétiques fonctionnels ainsi que par la complexité des systèmes mammifères et par notre compréhension trop partielle des dépendances de contexte des processus cellulaires. Dans cette thèse, j’ai proposé un certain nombre de concepts et d’approches pour traiter de ces problèmes. Premièrement, j’ai créé un cadre pour l’assemblage modulaire et combinatoire de vecteurs d’expression (multi)géniques et leur intégration ciblée efficace dans un locus chromosomique bien défini. Le potentiel de cette approche a été démontré par l’assemblage et l’intégration de plusieurs réseaux de régulation mammifères fonctionnels, incluant notamment le plus grand circuit génétique construit et intégré chromosomiquement à ce jour (6 unités de transcription, 27kb), fonctionnant comme une unité de mémoire inductible. Une telle plateforme de prototypage est bien adaptée pour les analyses comparatives d’éléments de régulation génique, de gènes et de circuits multigéniques, ainsi que le développement aisé de collections de lignées cellulaires isogéniques. Deuxièmement, j’ai développé une plateforme pour l’identification et la caractérisation de nouveaux systèmes de recombinase à sérine de Mycobacteriophages afin d’étendre les outils disponibles pour l’ingénierie des génomes mammifères. J’ai validé l’approche en identifiant 26 nouvelles recombinases à sérine dans 400 génomes de Mycobacteriophages, dont 4 utilisent des sites de recombinaison nouveaux. Ces recombinases sont fonctionnelles chez E. coli et dans des cellules mammifères. De plus, j’ai montré que l’on pouvait créer pour chacune d’elles un ensemble de paires de sites de recombinaison orthogonales.
Pour dépasser les limites de nos capacités à construire des systèmes cellulaires, j’ai également développé deux nouveaux systèmes de communication intercellulaire afin de faciliter le découplage spatial des différents modules d’un système synthétique. Le premier est constitué de deux modules, émetteur et receveur, qui peuvent être intégrés dans une population cellulaire unique pour créer un système de type autocrine ou intégrés dans deux populations cellulaires distinctes pour créer un système de type paracrine. Pour créer le module d’émission, j’ai assemblé et intégré une voie métabolique synthétique faite d’enzymes de différentes plantes et produisant une petite molécule diffusible, la phlorétine. Cette molécule, orthogonale aux voies de signalisation mammifères, peut être détectée par le module de réception contenant un système d’expression génique intégrant des éléments d’origine bactérienne et mammifère. J’ai créé un second système de communication intercellulaire, permettant le transfert de protéines entre populations cellulaires émettrices et receveuses. Ce système utilise des virus-like particles (VLPs). J’ai démontré que l’on pouvait induire la production de particules contenant des recombinases (Cre et B3) par les cellules émettrices, qui pouvaient ensuite induire un réarrangement génomique activant l’expression d’un transgène dans la population receveuse. Même si les thérapies utilisant des cellules intégrant des circuits synthétiques pour réparer des organes non-fonctionnels ou pour créer de-novo des tissus ne sont encore qu’une perspective lointaine, je crois que les contributions développées au cours de ma thèse peuvent être utiles au développement de la biologie synthétique des mammifères, que ce soit en accélérant le développement de circuits synthétiques d’intérêt thérapeutique ou en apportant de nouveaux outils pour mieux comprendre les processus cellulaires sous-jacents.
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