Development of methods for preparation and freezing of protein crystals with a 6-axis robotic arm, in order to improve X ray diffraction.
Amélioration et automatisation des étapes de préparation des cristaux de protéines à la diffraction aux rayons X
Résumé
La cristallographie est la technique qui contribue le plus à l'analyse des structures des macromolécules biologiques à la résolution atomique. Dans ce manuscrit de thèse nous abordons des développements instrumentaux pour l'amélioration et l'accélération des étapes expérimentales dans la procédure de mesure de la diffraction aux rayons X. En effet, les étapes de préparation des cristaux de protéine à la diffraction aux rayons X constituent la cause principale du goulot d'étranglement dans les plateformes à haut débit de la cristallisation des protéines jusqu'à la résolution des structures. Premièrement, la diffraction in situ aux rayons X des cristaux à la température ambiante, dans les plaques de cristallisation, est une méthodologie émergeante dans la cristallographie des protéines avec des capacités bénéfiques dans le criblage des cristaux mais aussi dans la résolution de structures. Cependant, un grand nombre de cristaux devront être centrés puis analysés par la diffraction aux rayons X automatiquement l'un à la suite de l'autre. Ainsi, un système automatisé répondant à cette exigence est présenté et évalué dans ce manuscrit comme étant l'un des résultats des études menées au cours de cette thèse. Deuxièmement, des études et des développements d'automatisation des étapes d'extraction et de micromanipulation, de cryo-protection et de congélation rapide pour la préparation des cristaux à la diffraction aux rayons X sont décrits dans ce manuscrit, ainsi que les résultats des expériences et des évaluations. Avec une approche nouvelle, les cristaux sont manipulés grâce à une micro-pince montée sur un bras robotique 6-axes pour les préparer et les analyser avec la possibilité de rotation de 360° pour la diffraction aux rayons X à longueur d'onde constate et à température cryogénique. Des cristaux des protéines lysozyme et NikA Fe-EDTA ont été préparés et diffractés avec cette nouvelle méthode. La comparaison structurale ne montre pas de différence entre la nouvelle méthode et celle manuelle, cependant la robustesse, la répétabilité et le gain de temps d'expériences sont significativement améliorés. Finalement, différents scénarios d'intégration des méthodologies présentées, met en évidence leurs intérêts dans les plateformes tout automatisés de cristallographie des macromolécules biologiques.
Crystallography is from far the most contributing technique for the structure analysis of macromolecules at atomic resolution. In this thesis, instrumentation development issues to improve and accelerate experimental procedures for X-ray diffraction experiments are tackled. Indeed the preparation steps of protein crystals for X-ray diffraction data collection are the main causes of forming a bottleneck towards automated pipelines from protein crystallization to structure resolution. Firstly, an emerging method in today macromolecular crystallography is the room temperature in situ X-ray diffraction of protein crystal samples in their crystallization drops, with proven benefits in crystal screening and also structure resolution. However, it requires a great number of crystals to be centered and diffracted in a row. Thus a fully automated system providing a solution to this requirement is presented and assessed in this manuscript as one of the results of this PhD studies. Secondly, in this manuscript, studies and developments on automating harvesting, cryo-protecting and flash-cooling steps of protein crystals preparation for X-ray diffraction are reported, as well as assessment experiments and results. With a new robotic approach, crystals are manipulated with a micro-gripper on a 6-axis robotic arm to prepare and to analyze crystals with 360° rotation possibility for cryo-temperature single wavelength X-ray diffraction. Lysozyme and NikA Fe-EDTA protein crystals has been prepared and diffracted with this new method. Structural comparisons show no differences between the new methodology and the manual one, while robustness, repeatability and experimental time are significantly improved. At last, different integration scenarios of the presented methodologies, highlights their interest in fully automated macromolecular crystallography pipelines.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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