In Vivo study of rat multi whisker integration using two photon fluorescence microscopy
Etude en microscopie de fluorescence à deux photons in vivo de l'intégration multi vibrissale chez le rat
Résumé
Rats possess an array of long whiskers, they can actively move and which enable them to explore space, localize objects and discriminate textures. Sensory information coming from follicles' mecano receptors where whiskers are inserted goes through mesencephalic and thalamic relays and reaches discrete units, called "barrels", in layer IV of the primary somato-sensory cortex. Then, sensory information spreads to layer II/III of the primary somato-sensory cortex where horizontal connections enable integration of information coming from several whiskers. My work tackles the question of multi whisker integration in the somato-sensory cortex using in vivo two photon microscopy and covers mainly two chapters. I first deal with all the optical developments in two photon microscopy that were realized in order to optimize in vivo recordings of the neuronal activity. Then, I consider the question of multi whisker integration using this technique. I developed an original two photon microscopy set-up which is able to record neuronal activity in layer II/III of the cortex while giving access to the recorded neuronal network architecture. That microscope allows high speed detection of single calcium transiants while requiring low power from the excitation laser. Thus, both photo bleaching and photo toxicity are limited. Furthermore, I identified noise sources during in vivo recordings and implemented appropriate solutions (holding system, image movement correction algorithm...) to reduce or correct these noises in order to be limited only by shot noise. Finally, I evaluated individual cells recordings quality excluding all risk of important contamination by neuropil signal. Using that two photon microscope, I have studied the neuronal responses in layer II/III to different stimulations. First, applying multi-whisker stimulations showing either no or full correlations between the whiskers, I have shown that neurons are spatially segregated depending on their response to these multi-whisker stimuli, this segregation being related to the below barrel organization in layer IV. Then, I have looked at neuronal responses induced by single whisker deflections as a function of two parameters: the stimulus "phase" in the 2D space of preferred stimuli and the stimulus direction in the 2D physical space. I have shown the absence of strong correlation between "phase" and direction tunings.
Le rat possède un ensemble de longues vibrisses qu'il peut bouger activement, ce qui lui permet d'explorer l'espace, de localiser les objets et de discriminer des textures. L'information sensorielle provenant des récepteurs périphériques des follicules où s'insèrent les vibrisses atteint, via des relais mésencéphaliques et thalamiques, des modules discrets, appelés " tonneaux ", de la couche IV du cortex somato-sensoriel primaire, puis se propage entre autre à la couche II/III du cortex somato-sensoriel primaire. Dans cette couche, des connexions horizontales permettent l'intégration d'informations provenant de plusieurs vibrisses différentes. Mon travail de thèse s'articule autour de la question de l'intégration multi-vibrissale dans le cortex somato-sensoriel chez le rat et est abordé grâce à la microscopie à deux photons in vivo. Il est partagé principalement en deux chapitres, le premier traitant de l'ensemble des développements optiques en microscopie à deux photons réalisés pour optimiser des enregistrements in vivo de l'activité neuronale, l'autre abordant la question de l'intégration multi-vibrissale au moyen de cette technique. J'ai donc développé un montage de microscopie à deux photons original capable d'enregistrer l'activité neuronale en couche II/III du cortex tout en donnant accès à l'architecture des réseaux enregistrés. Ce microscope permet de détecter à haute cadence des signaux calciques individuels tout en nécessitant une puissance modérée du laser d'excitation, ce qui limite la photo toxicité et le photo blanchiment. J'ai par ailleurs identifié quantitativement les différentes sources de bruits lors des enregistrements in vivo et mis en œuvre des solutions ad hoc (système de contention, algorithme de recalage des images...) pour réduire ou corriger ces bruits afin de n'être plus limité que par le bruit de photon. Enfin, j'ai estimé la qualité des enregistrements des cellules individuelles en excluant tout risque de contamination violente par des signaux collectifs tels que ceux provenant du neuropil. A l'aide de ce microscope, j'ai montré qu'il existe en couches II/III une ségrégation cellulaire selon un comportement globale ou local et que cette ségrégation s'articule au-dessus de l'organisation des tonneaux en couche IV, les cellules globales présentant une densité plus forte au-dessus des septa tandis que les cellules locales sont plus représentées au-dessus des tonneaux. Par ailleurs, au sein de la couche II/III du cortex j'ai mis en évidence l'absence de corrélation forte entre les sélectivités à la phase (dans l'espace 2D des stimuli optimaux mono-vibrisses) et à la direction (dans l'espace 2D physique) et posé les bases d'une étude de l'organisation spatiale de ces différentes sélectivités avec l'ébauche d'une cartographie fonctionnelle.
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