Studies of alpha-pinene degradation pathway of Pseudomonas rhodesiae in biphasic liquid/liquid medium
Etudes sur la voie de dégradation de l'alpha-pinène chez Pseudomonas rhodesiae en milieu biphasique liquide/ liquide
Résumé
The first part of the study deals with the bioconversion of -pinene oxide into cis-2- methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienal (isonovalal) by purified -pinene oxide lyase from Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 in a water-organic solvent, two-phase medium. The product is purified and its physicochemical properties are estimated. Correction for precursor losses by thermal degradation during GC analysis, by spontaneous auto-oxidation and by air stripping shows that the true bioconversion yield is close to 100 %. -pinene oxide lyase is also purified and some structural elements are given. Kinetic constants are estimated (KS = 27 μmol.L-1, rSmax= 97 μmol.min-1.mg-1 and turn-over = 230,000 mol.mol-1). It is shown that an interfacial inactivation of the purified lyase takes place when the enzyme is contacted with the water/hexadecane interface. Inactivation by isonovalal is also proved. Finally, a strong induction of the enzyme synthesis by -pinene during the biocatalyst production step is evidenced. The second part of the study reports feasibility and optimization of a-pinene oxide bioconversion to trans-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienoic acid (novalic acid) with P. rhodesiae fresh cells. Initial metabolic steps of the a-pinene degradation pathway of " novas " compounds are also investigated. The final process allows the recovery of 16 g.L-1 novalic acid after 7.5 h process, which corresponds to an average rate of 2.2 g.L.h-1, the average yield being 47 % and the biocatalyst content 7 g.L-1
La première partie du travail présenté porte sur la bioconversion de l' -pinène oxyde en cis-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienal (isonovalal) par l' -pinène oxyde lyase de Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 en milieu biphasique eau / hexadécane. Le produit de la bioconversion est purifié et ses caractéristiques physico-chimiques sont estimées. La correction de phénomènes de dégradation thermique, de perte par dégradation chimique et par entraînement dans la phase gazeuse montre que le rendement réel de bioconversion est proche de 100 %. L' -pinène oxyde lyase est également purifiée et des éléments concernant sa structure sont recueillies. Ses constantes cinétiques sont estimées (KS = 27 μmol.L-1, rSmax = 97 μmol.min-1.mg-1 et turn-over = 230.000 mol.mol-1). Une inactivation interfaciale de l'enzyme purifiée au contact d'une interface eau/hexadécane est mise en évidence. Une inactivation par le produit de bioconversion est également démontrée. Enfin, l'étude met en évidence une induction de la production de l'enzyme par l' -pinène au cours de la production du biocatalyseur. La deuxième partie du travail présenté concerne la mise au point et l'optimisation d'un procédé de bioconversion de l' -pinène oxyde en acide trans-2-methyl-5- isopropylhexa-2,5-dienoïque (acide novalique) par des cellules intactes de P.rhodesiae. Les étapes métaboliques initiales de la voie de dégradation de l' -pinène selon les composés " novas " sont étudiées en parallèle. Le procédé final permet d'obtenir 16 g.L-1 d'acide novalique produit en environ 7,5 h, ce qui correspond à une vitesse de 2,2 g.L-1.h-1, avec un rendement moyen de 47 %, à partir de 7 g.L-1 de biomasse.