Structural and enzymatic study of the complex between tRNASec and selenocysteine synthase SelA
Etude structurale et enzymatique du complexe entre l'ARNtSec et la Sélénocystéine Synthase SelA
Résumé
Selenium is both a toxic pollutant and an essential trace element, which is contained in selenocysteine, known as the 21st aminoacid. In selenoproteins, this aminoacid is often a primordial residu situated in the enzymatic actif site. The incorporation of selenocysteine is performed by the ribosome during translation and involves recoding of a Stop codon (UGA) of the selenoprotein's messenger RNA. The mechanism requires a signal sequence on this mRNA called SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence). Thus, selenocysteine is an exception of the genetic code : unlike canonical aminoacids, it is synthetised on its tRNA, and subsequenty incorporated by specific factors. This original biosynthesis on the tRNASec is found, in slightly different forms, in all three domains of life. In Eubacteria, SelA is the enzyme responsable for the selenocysteine biosynthesis on its tRNASec. We report here the structural and enzymatic studies of the complex between SelA and tRNASec, for the organisms E. coli and M. thermoacetica taken as exemples. This report presents first the crystallogenesis of both complexes followed by a biochemical study of the macro-complex formation between decameric SelA and up to 5 tRNASec. We took advantages of techniques such as microcalorimetry, chemical footprinting and activity measurement. Finally, a discussion on these new data towards the understanding of SelA function and origin is described.
Le sélénium est à la fois un polluant toxique et un oligo-élément essentiel, qui entre dans la composition de la sélénocystéine : le 21ème acide aminé du code génétique. Dans les sélénoprotéines, cet acide aminé est souvent un résidu primordial situé au site actif de l'enzyme. L'incorporation de la sélénocystéine est effectuée lors de la traduction, par le ribosome, grâce à un "recodage" d'un codon Stop (UGA) de l'ARN messager de la sélénoprotéine. Le mécanisme requiert la présence d'une séquence signal dans cet ARNm appelée SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence). La sélénocystéine est donc une exception du code génétique : contrairement aux acides aminés canoniques, elle est synthétisée sur son ARNt, puis incorporée grâce à des facteurs spécifiques. Cette biosynthèse originale sur l'ARNtSec se retrouve, sous des formes légèrement différentes, dans les trois domaines du vivant. Chez les eubactéries, l'acteur de l'étape clé de cette biosynthèse est SelA, enzyme responsable de l'incorporation du sélénium conduisant à la sélénocystéine au niveau de l'ARNtSec. En prenant comme exemples les organismes E. coli et M. thermoacetica, cette thèse rapporte l'étude structurale et enzymatique du complexe formé par SelA et l'ARNtSec. Il est abordé dans un premier temps la cristallisation du complexe pour les deux organismes d'étude, puis l'étude biochimique de la formation du macro-complexe entre l'enzyme décamérique SelA et jusqu'à 5 ARNtSec. Nous avons pour cela tiré parti des techniques de micro-calorimétrie, d'interférences chimiques et de mesures d'activité. Une discussion sur l'apport de ces nouvelles données sur l'interprétation du fonctionnement du complexe complète cette étude.