BINDING OF CELL PENETRATING PEPTIDES TO AN ANTI-TUMORAL AGENT AND EVALUATION OF THE EFFICIENCY OF THE COMPLEXES
COUPLAGE DE PEPTIDES DE PENETRATION CELLULAIRE A UN AGENT ANTI-TUMORAL ET EVALUATION DE L'EFFICACITE DES COMPLEXES
Résumé
The transport of substances equiped with pharmacological properties through the plasma membrane and their access to the various intracellular compartments, in particular the cytoplasm and the nuclei, remains an obstacle for biotechnological and biomedical research and pharmaceutical industry. Among the currently known means to introduce substances into cells, the peptides of translocation also called CPPs (Cell- Penetrating-Peptides) which represent a particularly interesting vector. In this work, we used three CPPs, Tat, penétratine and an analogue of the maurocalcine (MCa Abu ) for the delivery of the doxorubicine (Dox), a drug used in anti-cancer chemotherapy and which its effect is limited by the resistance of tumoral cells. In order to evaluate the effectiveness of the three formed complexes (Dox-CPPs), two cellular models of mammalian cancer were used; MDA-MB 231 cells and MCF7 cells which have different sensitivity to the drug alone. Our study enabled us to show initially that the three CPPs used represent powerful vectors for the translocation of the Dox inside the cells and that the conjugation of drug circumvented the resistance of MDA-MB 231 cells to Dox. We also showed that the distribution of free Dox is rather nuclear when unconjugated and cytoplasmic when it is conjugated to CPPs. In the second part of our work, we showed that Dox as well as Dox-CPPs induce the apoptosis of MDA-MB 231 cells and that this effect is observed by treating the cells with an amount five times weaker of Dox-CPPs compared to Dox.. This death is dependent on caspases and implies the mitochondrial way. Moreover, the apoptosis induced by Dox is mediated by the reactive oxygen spices (ROS). Those are partly implied in the apoptosis induced by Dox-CPPs since the use of an inhibitor of ROS partially inhibits the apoptosis induced by these compounds. We also showed that the surexpression of Bcl-2 protects the apoptosis induced by Dox and partially by Dox-CPPs, which suggests that another way is implied in the apoptosis induced by Dox-CPPs and who would explain the strongest toxicity of these compounds. Concerning this second way we could shown that the TRAIL death receptors are well implied in the apoptosis induced by Dox-CPPs via the membrane capping of the of d DR4 and DR5 receptors. This capping modifies the rate of expression of these membrane receivers and in the origin of sensitizing MDA-MB 231 cells with the endogenous TRAIL during the apoptosis induced by Dox-CPPs. Such a sensitizing with the TRAIL is at the origin of the céramide generation, which constitutes another way of induction of apoptose by Dox-CPPs in addition to the mitochondrial way. The whole of these results should enable us to develop a strategy of coupling of CPPs to antitumor agents in order to improve their effect and to better understand the ways of indication of the death induced following the coupling. This could in the long term lead to the design of new analogues of higher therapeutic index Key words: Cell- Penetrating-Peptides, doxorubicin, cellular resistance, apoptosis, ROS, death receptors, ceramide.
Le transport de substances dotées de propriétés pharmacologiques au travers de la membrane plasmique ainsi que leur accès aux divers compartiments intracellulaires, en particulier le compartiment cytoplasmique et nucléaire, demeure un obstacle pour la recherche biotechnologique et biomédicale et pour l'industrie pharmaceutique. Parmi les moyens actuellement connus pour introduire des substances dans les cellules, les peptides de translocation également dénommés CPPs (Cell- Penetrating-Peptides) qui représentent des vecteurs particulièrement intéressants. Dans le présent travail, nous avons utilisé trois CPPs, Tat, penétratine et un analogue de la maurocalcine (MCaAbu) pour la délivrance de la doxorubicine (Dox), une drogue utilisée en chimiothérapie anticancéreuse et dont son effet est limité par la résistance des cellules tumorales. Afin d'évaluer l'efficacité des trois complexes formés (Dox-CPPs), deux modèles cellulaires du cancer mammaire ont été utilisés; les cellules MDA-MB 231 et les cellules MCF7 qui présentent une sensibilité différente à la drogue seule. Notre étude nous a permis de monter en premier lieu que les trois CPPs utilisés représentent de puissants vecteurs pour l'entrée de la Dox à l'intérieur des cellules et que la conjugaison de la drogue a contourné la résistance des cellules MDA-MB 231 à la Dox. Nous avons également montré que la distribution de la Dox est plutôt nucléaire à l'état libre et cytoplasmique lorsqu'elle est couplée aux CPPs. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons montré que la Dox ainsi que les Dox-CPPs induisent l'apoptose des cellules MDA-MB 231 et que cet effet est observé en traitant les cellules avec une dose cinq fois plus faible de Dox-CPPs par rapport à la Dox. Cette mort est dépendante des caspases et implique la voie mitochondriale. De plus, l'apoptose induite par la Dox est médiée par les radicaux oxygénés (ROS). Ceux-ci sont en partie impliqués lors de l'apoptose induite par les Dox-CPPs puisque l'utilisation d'un inhibiteur de ROS inhibe partiellement l'apoptose induite par ces composés. Nous avons montré également que la surexpression de Bcl-2 protège l'apoptose induite par la Dox et partiellement par les Dox-CPPs, ce qui suggère qu'une autre voie est impliquée dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs et qui expliquerait la plus forte toxicité de ces composés. Concernant cette deuxième voie nous avons pu montré que les récepteurs de mort TRAIL sont bien impliqués dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs via la clustérisation membranaire des récepteurs de mort DR4 et DR5. Cette clustérisation modifie le taux d'expression de ces récepteurs membranaires et à l'origine d'une sensibilisation des cellules MDA-MB 231 au TRAIL endogène au cours de l'apoptose induite par les Dox-CPPs. Une telle sensibilisation au TRAIL est à l'origine de la génération de céramide, qui constitue une autre voie d'induction d'apoptose par les Dox-CPPs en plus de la voie mitochondriale. L'ensemble de ces résultats devraient nous permettre à valoriser la stratégie de couplage des CPPs à des agents antitumoraux afin d'améliorer leur effet et de mieux comprendre les voies de signalisation de la mort induite suite au couplage. Ceci pourrait à terme conduire à la conception de nouveaux analogues d'index thérapeutique plus élevé. Mots clés : Cell- Penetrating-Peptides, Doxorubicine, résistance cellulaire, apoptose, ROS, récepteurs de mort, céramide.