DNA micro-manipulation En route to a direct visualization by fluorescence microscopy

Micro-manipulation de l'ADN Vers une visualisation directe par microscopie de fluorescence

Adrien Meglio (1, 2)

1 LPS - Laboratoire de Physique Statistique de l'ENS
2 PASTEUR - Processus d'Activation Sélective par Transfert d'Energie Uni-électronique ou Radiatif (UMR 8640)

In this work, we present an apparatus designed to help unravel the molecular mechanism of a certain class of proteins. It combines the capabilities of a magnetic tweezers apparatus with those of a fluorescence microscope in TIRF mode. It has been designed to allow for mechanical manipulation and direct observation of DNA translocases at the single molecule level. We will first explain the design and testing of this setup. We will show that it does not only compare very well with the state of the art in magnetic tweezers or fluorescence microscope alone, but also that their combination lets us collect a new type of information. More specically, we studied the T7 RNAP polymerase and the FtsK motor from Escherichia coli . We will highlight the current questions arising concerning their mechanism of action, and propose a set of experiments to address them. Then we will explain why we had a lot of trouble obtaining the adequate fluorescent protein substrates, and how we believe we will solve this problem. We will finally analyze the results we obtained, either in bulk or magnetic tweezers experiments. They have unraveled new behaviours that we plan to use in new experiments on our combined MT/TIRF setup.

Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destiné à aider à la détermination du mécanisme de certaines protéines. Cet outil, qui combine un appareil de pinces magnétiques, et un microscope de fluorescence en ondes évanescentes, a été conçu pour permettre à la fois la manipulation mécanique et l'observation de l'activité d'ADN translocases à l'échelle de la molécule unique. Nous présentons d'abord ici la conception, la réalisation et l'expérimentation de ce montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement à ses composants séparés (pinces magnétiques et microscope de fluorescence), et que d'autre part leur réunion dans un appareil unique permet d'obtenir des résultats d'un type nouveau. Nous avons orienté l'étude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de deux protéines : le moteur FtsK de Escherichia coli et l'ARN Polymérase de T7. Nous détaillons dans cette étude les questions importantes encore en suspens concernant le mécanisme et présentons les expériences que nous avons envisagées pour y répondre. Nous relatons ensuite également la difficulté que nous avons rencontrée à obtenir des substrats protéiques adaptés aux expériences que nous avons envisagées, et les solutions que nous avons mises en oeuvre pour y remédier. Enn, nous analysons les résultats obtenus dans des expériences en volume ou en pinces magnétiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements et de préparer la réalisation de nouvelles expériences sur notre montage combiné.

Mots clés: biophysics; statistical physics; RNAP; TIRF

Mots clés: physique statistique; ADN polymérase; T7; FtsK; fluorescence; pinces magnétiques; biophysique

Domaines: Biophysique [physics.bio-ph]

Adrien Meglio. Micro-manipulation de l'ADN Vers une visualisation directe par microscopie de fluorescence. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00558689⟩