Regulation of a gene transcription by RNA Polymerase III in Saccharomyces cerevisiae. The role of evolutionary conserved domains of the Maf1 protein, RNA Polymerase III repressor.
Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae. Rôle des domaines conservés au cours de l'évolution de la protéine Maf1, un répresseur de l'ARN polymérase III
Résumé
Yeast cell encounters numerous environmental situations that require a rapid and efficient adaptation of cellular metabolism to changing life conditions. One of the first responses is the inhibition of RNA polymerase III (Pol III) transcription. The Maf1 protein, the unique negative regulator of the Pol III apparatus in Saccharomyces cerevisiae (Sc), is conserved through evolution. The family of eukaryotic Maf1 share highly conserved amino acid sequence with two easily recognizable regions called A and BC domains. The work performed during this PhD thesis concerns the role of these evolutionary conserved domains in the activity of ScMaf1. I have constructed a library of Maf1, identified and localized the mutations of corresponding Maf1 proteins and studied the phenotype. Using yeast two-hybrid system, I have found the A and BC domains interact physically and defined the minimal 34 aa fragment of the A domain involved in this interaction. Using genetic screen for internal suppressor mutations, I have identified that mutations localized in BC domain (D250E, V260D-N344I) recovered the activity of Maf1 mutated in A domain (K35E), as deduced from no defected growth, efficient Pol III repression, phosphorylation and cellular localization of identified suppressors. The identified K35E mutation disrupted physical interaction between Maf1 domains unless the presence of additional D250E or V260D-N344I suppressor mutations occurred. The Take Home message from the results obtained during my PhD thesis is that: “Full repression of Pol III requires the physical interaction between Maf1 domains”.
Dans l'environnement, la levure doit faire face à des conditions variées qui nécessitent une adaptation rapide du métabolisme cellulaire. Une des premières réponses est l'inhibition de la transcription par l'ARN polymérase III (Pol III). La protéine Maf1, le seul régulateur de la machinerie de la Pol III chez Saccharomyces cerevisiae (Sc), est conservée au cours de l'évolution. Les protéines Maf1 des Eucaryotes contiennent deux domaines A et BC phylogénétiquement conservés. Ce travail de thèse a cherché à identifier le rôle de ces domaines dans la fonction de la protéine ScMaf1. J'ai construit une banque de mutants de Maf1, identifié les changements dans leurs séquences ainsi que leurs phénotypes. En utilisant la technique du double-hybride, j'ai montré que les domaines A et BC interagissent physiquement et que l'extrémité N-terminale de 34 acides aminés du domaine A est le fragment minimal nécessaire à cette interaction. Grâce à un crible génétique, j'ai mis en évidence que les mutations du domaine BC (D250E et V260D-N344I) permettent de restaurer l'activité de Maf1 mutée dans le domaine A (K35E). Cette restauration est observable pour le phénotype, la répression efficace de la transcription par la Pol III, le niveau de phosphorylation et la localisation cellulaire de Maf1. La technique du double-hybride m'a permis aussi de montrer que la mutation K35E inactive partiellement l'interaction entre les domaines de Maf1 qui est restaurée par les mutations suppresseurs D250E et V260D-N344I. Les résultats permettent de conclure que : « la répression de la transcription par la Pol III requiert l'interaction physique des domaines de Maf1 ».
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