Caractérisation fonctionnelle et mécanisme de l'inhibition de ExsA, régulateur clef du Système de Sécrétion de Type III de Pseudomonas aeruginosa. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2010

Functional characterization and mechanism of inhibition of ExsA, the master regulator of the Pseudomonas aeruginosa Type Three Secretion System.

Caractérisation fonctionnelle et mécanisme de l'inhibition de ExsA, régulateur clef du Système de Sécrétion de Type III de Pseudomonas aeruginosa.

Résumé

Expression of the genes encoding the Type Three Secretion System T3SS, major virulence factor of Pseudomonas aeruginosa, is under the positive transcriptional control of ExsA. This activator is a member of the AraC/XylS family of transcriptional regulators characterized by a DNA binding domain containing two helix–turn–helix motifs. The activity of these proteins is generally modulated by a ligand which binds to an additional non-conserved domain. AraC/XylS family members involved in SST3 control can be regulated by protein ligands. The ExsA activity is inhibited by the anti-activator ExsD. The study of the functional domains of ExsA through in vitro and in vivo approaches showed that the C- terminal of ExsA is the DNA-binding domain and that two monomers bind to the promoter of the exsCEBA regulatory gene operon (pC). However, this domain possesses a lower affinity for pC and a lower transcriptional activity than the entire protein. Indeed, the efficient binding of ExsA to pC requires its dimerization through its N-terminal domain. The last -helix of this domain seems to play a crucial role in this dimerization. The second goal of my work was to understand the interaction between ExsA and ExsD and to define the molecular mechanism of inhibition used by the anti-activator. By co-producing the two proteins, we succeeded to purify and characterize the ExsA-ExsD complex. ExsA and ExsD form a heterodimeric complex within which ExsD prevents ExsA from binding to its target sequences.
L'expression des gènes codant pour le Système de Sécrétion de Type III (SST3), facteur de virulence majeur de Pseudomonas aeruginosa, est activée par ExsA. Ce facteur de transcription appartient à la famille des régulateurs de type AraC/XylS caractérisés par un domaine de fixation à l'ADN comportant deux motifs hélice-tour-hélice. L'activité de ces protéines est généralement régulée par la fixation d'un ligand sur un domaine supplémentaire non conservé. Ce ligand peut être de nature protéique dans le cas de certains régulateurs contrôlant la synthèse de SST3. Ainsi, l'activité transcriptionnelle de ExsA est inhibée par l'anti-activateur ExsD. L'étude de la fonctionnalité de ExsA et de ses domaines par des approches in vitro et in vivo a révélé que le domaine C-terminal de ExsA est bien le domaine de fixation à l'ADN et que deux monomères se fixent sur le promoteur de l'opéron des gènes de régulation du SST3 (pC). Ce domaine isolé possède une affinité pour pC et une activité transcriptionelle inférieure à celle de ExsA. En effet, la fixation efficace de ExsA sur le promoteur pC requiert sa dimérisation à travers son domaine N-terminal. La dernière hélice  de ce domaine N-ter semble jouer un rôle majeur dans la dimérisation de ExsA. Le deuxième objectif de ma thèse était de comprendre l'interaction entre ExsA et ExsD et d'identifier le mécanisme grâce auquel l'inhibiteur empêche ExsA d'activer la transcription des gènes du SST3. Après co-production des deux protéines, le complexe ExsA/ExsD a été purifié puis caractérisé. ExsA et ExsD forment un complexe hétérodimérique au sein duquel l'inhibiteur empêche le facteur de transcription de se fixer à l'ADN.
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Dates et versions

tel-00461581 , version 1 (05-03-2010)

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  • HAL Id : tel-00461581 , version 1

Citer

Julie Thibault. Caractérisation fonctionnelle et mécanisme de l'inhibition de ExsA, régulateur clef du Système de Sécrétion de Type III de Pseudomonas aeruginosa.. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00461581⟩
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