Probing molecular interactions by NMR: the DHFR behaviour in presence of osmolytes and NMR structures of antimicrobial peptides in membrane models.
Analyse d'interactions moléculaires par RMN : Étude de la DHFR en présence d'osmolytes et structures de pseudopeptides antimicrobiens en environnement membranaire
Résumé
This manuscript is divided in two chapters; the first one deals with the osmolytes effect on the DHFR enzyme (dihydrofolate reductase) and the second one presents a structural study of antimicrobial pseudopeptides in model membranes. The osmolytes are small molecules accumulated by cells and tissues of a wide variety of organisms in response to hyperosmotic stress, in order to maintain the cellular volume. They contribute to saving the cellular integrity and to stabilizing the macromolecules from various environmental stresses. Nevertheless, enzyme activity is sometimes inhibited by these cosolutes and the molecular basis of their effects on the proteins properties is of great interest. We studied the DHFR, which is a key enzyme in the metabolism, in presence of osmolytes. We demonstrate that its overall structure is maintained, while the osmolytes stabilize the DHFR structure, they inhibit its activity at the same time. The dissociation rate constant, koff, of substrate analogues decreases with increasing the osmolyte concentrations and reflects the variation of DHFR catalytic rate. The study of the DHFR dynamic on several timescales gives answer on the origin of the DHFR inhibition in presence of osmolytes. The second chapter concerns the study of the structure-activity relationship for several antimicrobial peptides. The main objective of this project is to develop new drugs to face the increasing antibiotic resistance of pathogens against conventional antibiotics. We solved NMR solution structure and studied the behavior of peptides and pseudopeptides in various model membranes, SDS micelles and phospholipids, in order to propose a mechanism of action for each of them.
Ce mémoire de thèse est divisé en deux chapitres, le premier aborde l'impact des osmolytes sur la dihydrofolate réductase (DHFR) et le second a pour objet l'étude structurale de pseudopeptides antimicrobiens en présence de modèles membranaires. Les osmolytes organiques sont de petites molécules accumulées dans les cellules et les tissus de nombreux organismes lors d'une contrainte hyperosmotique pour maintenir le volume cellulaire. Ces solutés ont également un rôle essentiel dans la sauvegarde de l'intégrité cellulaire et dans la stabilisation des macromolécules contre l'effet de divers stress environnementaux. Les osmolytes peuvent néanmoins induire une inhibition significative des enzymes et les bases moléculaires de leurs effets sur les propriétés des protéines sont au centre de nombreuses études. Nous avons étudié la DHFR, une enzyme clé du métabolisme, en présence de divers solutés. Après avoir vérifié que les osmolytes ne modifiaient pas la structure globale de la DHFR, nous avons montré qu'ils étaient capables de stabiliser la structure et d'inhiber l'activité de cette enzyme. L'inhibition de la DHFR est liée à la diminution de la vitesse de sortie (koff) du produit, que nous avons mesurée en présence d'osmolytes. L'étude de la dynamique interne de la DHFR, sur plusieurs échelles de temps apporte des réponses sur l'origine de l'inhibition de la DHFR en présence d'osmolytes. La seconde partie présente nos travaux sur la relation structure-activité de plusieurs peptides antimicrobiens. Ce projet s'inscrit dans la course au développement de nouvelles molécules actives pour palier la résistance croissante des pathogènes contre les antibiotiques conventionnels. Nous avons déterminé les structures et étudier le comportement de différents peptides et pseudopeptides en environnement membranaire modèle, micelles de SDS et phospholipides afin de proposer un mode d'action pour chacun d'eux.