Study of class I and III histone deacetylases from the platyhelminth parasite Schistosoma mansoni
Etude des histones déacétylases (HDACs) de classes I et III du parasite plathelminthe Schistosoma mansoni
Résumé
Schistosomes are platyhelminth parasites that infect 200 million people and cause the death of 200,000 people each year throughout the world. Currently one drug, praziquantel, is used against all species of schistosome, but resistant strains have been isolated in endemic areas as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new therapies is therefore urgent. Enzymes involved in gene regulation are promising targets for new drugs because of their essential role in the cell. We have targetted the enzymes responsible for histone deacetylation, the histone deacetylases (HDACs) that are generally involved in repressing transcription. These enzymes are already studied as potential therapeutic targets in cancer and parasitic diseases such as paludism. They form a family highly conserved throughout evolution that is composed of four classes. Classes I, II and IV are HDACs that require an active site zinc ion, whereas the third class is made up of the sirtuins that are NAD+-dependent. The first part of the work was focused on class I HDACs. To investigate the conservation of these enzymes in Schistosoma mansoni, we cloned and characterized three class I HDACs, orthologues of mammalian HDAC1, 3 and 8, and confirmed their identities by phylogenetic analysis. The identification of an HDAC8 orthologue shows that it is not vertebrate-specific as previously thought and insertions in its catalytic domain suggest specific enzymatic properties. SmHDAC1, 3, and 8 mRNAs are expressed at all schistosome life-cycle stages. SmHDAC1 represses transcriptional activity in a mammalian cell line and this activity is dependent on its catalytic activity since transcription is partially restored by treatment with an HDAC inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) and a catalytic site mutant fails to repress transcription. In order to determine the extent and importance of histone acetylation in S. mansoni, we tested the effects of three HDACi on both larval and adult worms in culture. TSA, valproic acid (VPA) and suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) inhibited global HDAC activity at all life-cycle stages. TSA and VPA, but not SAHA, cause mortality of schistosomula and adults, with TSA showing the most rapid effect. Moreover, TSA causes an increase in apoptosis in schistosomula shown by the TUNEL assay and an increase in caspase 3/7 activity. Both TSA and VPA are shown to cause an increase in general levels of protein acetylation in schistosomes ; more particularly of histone 4 whereas histone 3 acetylation is less affected. In the case of TSA treatment this histone hyperacetylation is correlated with the increased expression of caspases 3 and 7 transcripts. Finally, quantitative chromatin immunoprecipitation shows that the proximal promoter region of the S. mansoni caspase 7 gene is hyperacetylated on histone H4 after TSA treatment The second part of the work targetted class III HDACs, sirtuins. The first of these enzymes, Sir2, was discovered in yeast and 7 orthologs, SIRT1 to 7, have been described in humans. We cloned and characterized a SIRT1 ortholog from S. mansoni that contains an insertion in its catalytic domain that may modify its activity and exhibits a potential phosphorylation site for PKB/Akt kinases. Sir2 and its orthologs have a very important role in lifespan regulation. Indeed, in the yeast as well as in other organisms such as C. elegans or the mouse, they interact with the transcription factor "Forkhead-Box Others" (FOXO) to extend lifespan in response to calorie restriction and are implicated in the regulation of the insulin receptor-dependent pathway, which involves PKB/Akt, FOXO and SIRT1 and controls cell metabolism, survival mechanisms and lifespan. Some of S. mansoni particularities are a long lifespan (more than 30 years in human), high calorie consumption and extreme fertility (more than 300 eggs laid each day by S. mansoni female worms). Taken together these characteristics are paradoxiacal since, in other organisms, calorie restriction increases lifespan and reduces reproduction. In order to dissect the mechanisms involved in this disregulation, we have also characterized SmFOXO. Transcripts of SmSIRT1 and SmFOXO are differentially expressed in the various S. mansoni life-cycle stages, but the expressed proteins interact positively to drive transcription in transfected mammalian cell lines. Future work will focus on the role of the insulin pathway on SmSIRT1/SmFOXO dependent gene transcription in vivo
La schistosomiase est la deuxième endémie parasitaire mondiale après le paludisme; 200 millions d'individus sont infectés à travers le monde et la morbidité reste élevée (environ 200 000 morts par an) malgré l'utilisation du praziquantel, seule drogue disponible. Cinq espèces de schistosomes infectent l'Homme dont celle que nous étudions, Schistosoma mansoni. Ce parasite possède un cycle de vie complexe, comportant 4 stades de développement morphologiquement distincts et 2 hôtes successifs, un hôte intermédiaire, le mollusque Biomphalaria glabrata et un hôte définitif, l'Homme. Afin de déterminer les mécanismes mis en jeu dans le contrôle du développement du schistosome et de caractériser des cibles potentielles de nouveaux agents chimiothérapeutiques, nous nous intéressons à certains acteurs impliqués dans la régulation génique, et plus particulièrement, les histones déacétylases, ou HDACs. Les HDACs sont des enzymes bien conservées dans le règne du vivant. Elles contrôlent l'expression de 5 à 10% des gènes, majoritairement en réprimant la transcription via la déacétylation des histones. Elles sont réparties en 3 classes, les classes I et II sont composées d'enzymes dont le site catalytique comporte un ion de zinc ; tandis que la classe III est composée des sirtuines, dépendantes du NAD+. Chez le parasite, une partie de nos études porte sur les 3 enzymes de classe I que nous avons identifiées et caractérisées au niveau moléculaire, SmHDAC1, 3 et 8. Ensuite nous avons réalisé une étude fonctionnelle de SmHDAC1 et mis en évidence sa capacité de répression de la transcription en système hétérologue. Puis nous nous sommes intéressés à l'inhibition de l'activité HDAC chez le parasite, grâce à l'utilisation de différents inhibiteurs des classes 1 et 2 des HDACs. Nous avons montré que des parasites cultivés en présence de trichostatine A (TSA) mouraient de manière dose dépendante. Nous avons approfondi notre étude au niveau moléculaire et avons étudié la variation d'acétylation des histones des parasites en présence de TSA et d'acide valproique. Nous avons montré une augmentation de l'acétylation de manière dose-dépendante de l'histone H4. Le traitement par la TSA entraîne la mort de nombreux types cellulaires par apoptose et provoque une surexpression de certains gènes impliqués dans ce processus. Nous avons démontré que ce traitement induit l'apoptose chez des larves maintenues en culture, ainsi qu'une activation des Caspases 3/7. Ensuite, la caractérisation des ADNc des Caspases 3 et 7 nous a permis de montrer par RT-PCR en temps réelle que les transcrits correspondants sont surexprimés après traitement par la TSA, tandis que celle-ci n'a aucun effet sur la transcription de SmHDAC1 et 3. Par la suite, nous avons corrélé cette augmentation avec le taux d'acétylation de H4 sur le promoteur de caspase7. Cette étude sera poursuivie à l'avenir par l'investigation de la relation structure/fonction des HDACs afin de développer des inhibiteurs spécifiques. En parallèle, nous étudions une HDAC de classe III, SmSirt1, que nous avons identifiée et caractérisée. La présence d'une grande insertion dans son domaine catalytique présage des fonctions modifiées par rapport à ses orthologues chez d'autres espèces. Nous souhaitons nous focaliser sur les conséquences de cette insertion spécifique chez S. mansoni. En effet, elle semble être la cible de potentielles modifications post-traductionnelles (site de phosphorylation par PKB/Akt), que nous voulons mettre en évidence. De plus, l'une des fonctions de Sirt1 est l'interaction avec le facteur de transcription FoxO et la régulation de la voie de signalisation insuline dépendante (impliquant PKB/Akt). Par ce biais FoxO et Sirt1 contrôlent le métabolisme, des mécanismes de survie cellulaire et la longévité. Une modification de la fonction de SmSirt1 pourrait être à la base de la durée de vie anormalement longue de S. mansoni. Nous avons donc également réalisé la caractérisation moléculaire de SmFoxO, afin de mettre en évidence son interaction avec Sirt1 ainsi que l'implication de cette interaction dans le contrôle de la transcription de gènes cibles. Par la suite nous étudierons le rôle de Sirt1 et FoxO dans la régulation de la signalisation insuline dépendante sur des parasites en culture